定量的マイクロ中和アッセイの最適化

注：以下のプロトコルのためのバイオセーフティーレベル（BSL）は潜在的なパンデミックインフルエンザウイルスの季節性インフルエンザウイルスとBSL 3+のためのBSL 2です。ウイルス滴定ウイルス対照（VC）のウイルス濃度を決定するために中和実験の前に必要とされます。 1.ウイルス滴定注：ウイルスの数と重複の数に応じて、ウェルプレートは、以下の柔軟性で設定することができます：（1）ウイルスの希釈は行または列（ 図1）のいずれかに沿って配置することができます。各ウイルスには、個別の行/列を占有する必要があります。 （2）ウイルス希釈増分は柔軟性があるが、それは左上隅に最高ウイルス濃度で開始する必要があります。 （3）複製の数に制限はありません。 注：マディンDarbyイヌ腎臓（MDCK）およびMDCK-SIAT1（SIAT）細胞は、博士M. Matrosovich、マールブルグ、GERによって提供されました10多くの。 SIAT細胞を安定的にヒトCMP-N-アセチルノイでトランスフェクションしたMDCK細胞である：シアル酸（SA）の発現増強のためのβガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子α2-6Galで終わるオリゴ糖。 96ウェルプレートにMDCK細胞またはMDCK-SIAT細胞8十分なアリコート（200μL/ウェル）。コンフルエンスに到達するために2または3日間、5％CO 2、37℃で細胞をインキュベートします。 10％熱不活化ウシ胎児血清（FCS）及び抗生物質（100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン）を補充したDMEM中で細胞を増殖。 5％CO 2及び1mg / mlのG418硫酸と、37℃でSIAT細胞をインキュベートします。 注：希釈係数を経験し、使用する細胞株に依存しています。細胞単層は、ウイルス接種の時に（ すなわち、無細胞壁またはMDCK細胞用の外形線およびMDCK-SIAT1細胞のための密集したレイアウト）コンフルエントでなければなりません。希釈液としては、例えば、基づきますMDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーを表1に示します。 ウェルあたりウイルス増殖培地（VGM）200μlで細胞を3回洗浄。 30分間、70％EtOHで多層プレートウォッシャーを殺菌し、その後洗浄する前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはVGMでそれをすすいでください。 VGMを吸引し、直ちに各ウェルにVGMの50μlを添加します。 （テストウイルスとの重複数に応じて、または少ない）6滅菌チューブのそれぞれにVGMの900μLを加えます。 、第1のチューブへのウイルスの100μLをピペットでよく混ぜ、およびシリアルに希釈し、各希釈の間にヒントを変更します。滴定する各ウイルスについて、この手順を繰り返します。 注：これは、10 -6に10 -1のウイルス希釈液を与えます。 9の重複ウェル（列9と図1の10）に、最高希釈（ 図1の1×10 -5）から始まる、各ウイルス希釈液50μLを追加6ウェルプレート。 ウイルスが細胞に感染することを可能にするために2〜3時間、37℃でプレートを置きます。 注：2〜3時間のインキュベーションは、接種物中のウイルスが単層に到達するのに十分な時間を持っていることを保証する必要があります。 オーバーレイを準備します（10ミリリットル/プレート） 注：オーバーレイは（材料リストを参照してください）2×DMEM、トリプシン（2 / mlの最終濃度）の5ミリリットル、1mg / mlのストックを20μl、およびセルロースコットンリンターの5ミリリットルで構成されています。 接種物を取り除きます。 オーバーレイ（各ウェルに200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩インキュベートします。 注：ウイルス出芽後の約4時間行われるので、プレートは、この時間の後に乱されないことが重要です。 井戸からオーバーレイを吸引します。 PBS A（200μL/ウェル）で氷冷4％パラホルムアルデヒドを追加します。 30分間または20分間、室温で4°Cでそれらを配置します。 注：PBS Aは10、外出先での自然なpHのリン酸緩衝食塩水であります塩化ナトリウム、塩化カリウム0.25gの、のNa 2 HPO 4、KH 2 PO 4 0.25 gを1.437 gの蒸留水1L（材料リストを参照）、F。 注：パラホルムアルデヒドを吸入したときに有害であると飲み込むと火傷を引き起こす可能性があります。そこ発がん性の限定的な証拠でもあり、それが皮膚に接触した後、感作を引き起こすことがあります。 パラホルムアルデヒドを吸引除去し、PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。 将来の使用のために4℃でPBS Aでプレートを保管し、または以下の手順で行います。 透過化バッファー（100μl/ウェル）を追加します。室温で30分間それを残します。 PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。 ウェルあたり、：（ELISAバッファーで千1）第一抗体を50μl、インフルエンザA型に対するマウスモノクローナル抗体を追加します。振とうしながら、1時間（または4℃で一晩）、室温で静置します。 洗浄緩衝液（0.05％のTween 80 PBS A、V / V）でのp100μlの中で3回洗浄よくえー。洗浄の間に5分間室温でインキュベート。代わりに、ウェル当たり300μlのを使用してインキュベーションすることなく、それを3回洗浄します。 ウェルあたり、：二次抗体50μlを、ヤギ抗マウスIgG（H + L）HRPコンジュゲート（ELISAバッファー1,000 1）を加えます。振とうしながら、1時間室温でインキュベートします。 ステップ1.17で説明したように、それを3回洗浄します。 基板（50μL/ウェル）を追加します。 30分間、または青色の発色がはっきりと見えるまで室温で静置します。 反応を停止させるために、洗浄の間に2 -3分間、室温でインキュベートし、ウェル当たりの蒸留水200μlでプレートを2回洗浄します。 （ 例えば、アルミホイルで包ん）プレートを空気乾燥し、暗所に保管してください。 2.滴定定量 図2aに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置きます。にL字型の位置の制限を使用します最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保します。 注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。 画像をスキャンします。 注：設定を表2に示します。 必要なウイルス濃度（ 図3）を計算するための「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。 画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」タブのヒストグラムで赤いバーをスライドさせます。画像への影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。 注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。 負荷または入力ウェルプレート定義マップ。 "：最適なウイルス集団（％）滴定」の閾値（ 例えば、30％）を示します。滴定の結果を計算するために「滴定プロセス」タブを選択します。滴定の結果を確認します。滴定の結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。 注：ソフトウェアの詳細命令について補足S1を参照してください。特注ソフトウェアのコピーは、要求に応じて入手可能です。 注：一般的に、各ウェル11内の50％（20から85パーセント）全細胞のICPの周りにプラーク減少アッセイ利回りのための最高のウイルス希釈。 3.ウイルス中和注：中和アッセイのために必要なプレートの数を計算します。各プレートは、1つのウイルスと抗血清の数を収容することができます。 注：抗血清の数と重複の数に応じて、ウェルプレートを目で設定することができますE以下の柔軟性：（1）血清希釈は、行または列（ 図4）のいずれかに沿って配置することができます。各血清は、別々の行または列を占めるべきです。 （2）血清希釈の増分は柔軟性があるが、それはプレートの左上隅に最高血清中濃度で開始する必要があります。 （3）重複数は、抗血清の数のバランスをとります。より多くの重複が実験的変動を平滑化するのに役立ちます。 （4）VCの数とセル制御（CC）の重複数は柔軟性があり、彼らはまた、独立した行または列にする必要があります。 VCの複製の数は、抗血清のそれよりも有意に大きいことが予想されます。 事前に2または3日間、ステップ1.1から1.3のように、細胞単層を準備します。 プレートの各ウェルにVGM50μlのを追加します。 それぞれ、VCおよびCCの列11と12を使用してください。コラムの最初の行（A）に一時20受容体破壊酵素（RDE）処理の血清50μlのアリコートを追加ナノ秒1-10。 注：各ウイルスと血清の組み合わせについて、アッセイは二重に行われるので、一方のプレートは、例えば、1つのウイルスは、5つの抗血清に対して試験含んでいてもよいです。 H（列図4の1月10日）を行ごとにAから50μLを移すと行H.から50μLを破棄することにより、2倍の段階希釈を行います CC欄（ 図4の列12）の各ウェルに希釈液の50μlのを追加します。 CCカラム（列1-11、行図4のAH）を除いて、プレートの各ウェルにウイルスの50μLを加えます。 2-3時間、37℃でそれをインキュベートします。接種物を取り除きます。各ウェルにオーバーレイ（200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩静置します。修正し、ウイルス滴定（1.11から1.22ステップ）の場合と同様に、プレートを染色します。 4.中和定量 Figuに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置き図2a再。最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保するために、L字型の位置の制限を使用してください。 注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。 ステップ2.2で説明したように、プレートをスキャンします。 必要なウイルス力価（ 図3、ステップ2.3）を計算するために、「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。 画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」で赤いバーをスライドさせます。影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。 注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。 よく-pの負荷または入力後半マップ。で、閾値（ 例えば、50％）を示す「中和：感染控除（％）。」 力価を計算するために、「中和プロセス」を選択します。力価を確認し、中和結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。 注：中和はVCに対して事前に定義されたICPの減少（例えば、50％や80％など）（ 図4の11列の平均）との血清の最高希釈の逆数として報告されています。 50％ICP減少は代表的な結果で使用されました。