אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול
Summary
מחקר זה מתאר מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
מבחני מיקרו-נטרול (MN) משמשים וירולוגיה עבור quantitation של נוגדנים מנטרלים וכן את פעילות אנטי. כחלופה של עיכוב hemagglutination (HI) מבחנים, מבחני MN יכולים להתגבר השפעות חד אנטיגני מושפעות משינויי הזיקה של קולטן מחייב נגיפי שפעת, אשר יכול לסבך את הפרשנות של HI תוצאות 1,2,3. עד לאחרונה, רוב מבחני MN התבססו על תופעות cytopathic (CPE) או מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 4,5. מבחני MN מבוסס על הפחתת מוקד ורובד פותחו 6,7,8 1990. מבחני הפחתת רובד להסתמך על ספירת הפלאק גלוי לכמת infectivity. עם זאת, ספירה חזותית לכסות רק לוחות גדולים כי הם פתירים על ידי עין אנושית, למרות שהרוב הפלאק הם קטנים ובלתי נראים לאיתור וירוסים במחזור נוכחי רבים. כיסוי חלקי זה יכול לגרום וריאציה משמעותית בין בוחנים בין ניסויים, שמוביל iתוצאות ncomparable. זה גם בלתי אפשרי להשתמש בשיטה כאשר וירוסים מסוימים מוצגים זיהום נפל של תאים בודדים או הפלאק קטן מאוד.
החלטת ספירת העניים ניתן לשפר על ידי כניסתה של פרוטוקול מבוסס-הדמיה. עם ההתקדמות הטכנולוגית, מיקרוסקופיה אופטית תפוקה גבוהה הקוראים גם צלחת יכול לספק אמצעי מדויק לספור את התאים הנגועים 9. תחת מיקרוסקופ טרנס-מואר, תאים נגועים מתויגים עם סמנים מסוימים עשויים להיות דמיינו לעומת הקליטה או קרינה שלהם בהחלטת משנה הסלולר. מדגם לאחר מכן ניתן לנתח על מסך מחשב.
למרבה הצער, בשל הגבלת שדה הראייה, יותר ממאה תמונות רעפים נדרשות לכסות היטב יחיד. ניתוח צלחת עם 96 בארות ידרוש ההדמיה והעיבוד של כעשר אלף תמונות. תהליך כזה מייגע הוא זמן רב ויקר, ואת ברזולוצית צבר היא בכללl מיותר לאפיון שגרת זיהומים נגיפיים. מעבדות עם תקציב מוגבל עשויות לגלות כי הגישה הבנויה סביב וסורק מספקת אלטרנטיבה חסכונית, תפוקה גבוהה.
במאמר זה, אנו מתארים assay MN הפחתת פלאק משופר כי הוא מתאים לאפיון אנטיגני של מספר רב של וירוסים ותוכנות עבור מדידת פעילויות אנטי כמותית ונוגדנים הניטרול. יש assay מספר יתרונות: ראשית, היא assay מבוססת הדמיה כי הוא מסוגל למדוד וירום ברמה התאית, ללא קשר לגודל פלאק. ספירת אוכלוסיית התא הנגועה הכוללת (ICP) בתוך באר מגדיל מאוד את רגישות זיהוי, מה שהופך אותו ניתן לאפיין את הווירוסים עם infectivity הנמוך. שנית, טיטרציה כמוני מדויקת יותר הוא הציג לפני נטרול כדי לקבוע את כמות נגיף קלט. וירוס קלט כמותית מפחית באופן משמעותי את Variation בין ניסויים שונים והופך את התוצאות יותר להשוות בין מעבדות. שלישית, טיטר נטרול ניתן לקבוע ישירות על ידי ניתוח תמונות, מה שהופך את quantitation מהיר וידידותי למשתמש. לבסוף, פרוטוקול מספק חסכונית אלטרנטיבה תפוקה גבוהה עם רזולוציה והדיוק הנדרשים. Quantitation מבוסס על וסורק ותוכנות עיבוד נתונים חינם. ההתקנה כולה יש טביעת רגל קטנה והוא פריסה ברוב המעבדות.
הפרוטוקול המובא במאמר זה מורכב מארבעה שלבים עיקריים, כולל טיטרציה וירוס, quantitation טיטרציה, נטרול הנגיף, quantitation הניטרול. טיטרציה וירוס הוא ניסוי הכנה שקובע את כמות וירוסים קלט לשמש הניטרול. במהלך טיטרציה, מספר ריכוזים ויראלי מוחלים על monolayers התא בצלחת 96-היטב. התאים הנגועים אז נבדקים ונרשמים בסעיף 2. dilu ויראליtion שמייצר 20% -85% ICP הוא בתורו מיושם כמו וירוסי קלט הנטרול המקביל סעיף 3. טיטר של פרוטוקול נטרול הם לכמת באמצעות סעיף 4. ניסויים שבאו בעקבות הפרוטוקולים הנ"ל מוצגים נציג תוצאות. את assay נבדק ביסודיות במהלך השנים האחרונות עם רוב נגיף שפעת במחזור הנוכחית, כגון A (H1N1) pdm09, A (H3N2), וירוסי B. התוצאות של אפיון נגיף שפעת נכללו בדוחות עבור פגישת יעוץ WHO כי נתן המלצות על החיסונים לשפעת לשימוש בחצי הכדור הדרומי בשנת 2016 בחצי הכדור הצפוני ב 2016-2017.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו תארנו assay MN מבוסס הדמיה לכמת את היחסים אנטיגני הנכונים בין וירוסים. לעומת מבחני פלאק-הפחתה אחרים, השיטה מדגישה מדידת ICP של באר כולו, הבטחת כיסוי מלא של האוכלוסייה התולעת. עצמאותה של הצטברות אבנית גם מרחיבה את היישום של assay כדי וירוסים שיכולים ליצור לוחות קטנים בלתי נראים בעיקר או שרק יכול לנהל זיהום תא בודד. לכן, assay היא מסוגלת לבחון יותר וירוסים ואת ההשפעות של מגוון רחב יותר של נוגדנים מ HI, וזה עוזר בצורה מקיפה יותר לשקף את הדמיון אנטיגני או הבדלים בין וירוסי 12. לדוגמא, כאשר carboxylate oseltamivir כלול, assay MN מושפע פחות NA התלוי מחייב, משקף את ההבדלים אנטיגני בצורה מדויקת יותר. במהלך הפיתוח של assay, נעשו מאמצים גדולים כדי לשפר את עקביות ניסוי, מהירות, וזיהוירגישות, כולל על ידי שליטת וירוסים קלט באמצעות טיטרציה ונרשמת, הדמית קצב העברת נתונים גבוהות עם סורק משטח אופקי, ויישום פלטפורמת עיבוד נתונים ידידותי למשתמש. התוצאות היו בדרך כלל בקנה אחד עם ואישר אלה של HI. יש לציין, כי התוצאות גם חשפו הבדלים אנטיגני בין הגירסות להיסחף אנטיגני של וירוסי סוג האחרונים ו- B חיסון, כמו גם שינויי אנטיגני נגרמים על ידי שינויים בתרבות שנבחרה או ספורדי, כגון החלפת G155E ב HA1 של מסוימים (H1N1) וירוסים pdm09 12.
הפרוטוקול מתאים לסוג הווירוס או תת-סוג עם מבחר של שורות תאים כי נתנו את הזיהום החזק, אשר משפר את אות ההדמיה. וריאציה ניסיוני הוחלקה עם העיצוב של כפילויות כי מאוזנת עם מספר נסיובי נבדק. חוסר ודאות יכולה גם לבוא איכות התמונה, אשר מושפעת בעיקר על ידי מכשיר ההדמיה. סורק הגון שטוח צבע יכול משמעותיficantly לשפר את הניגודיות בתמונה להפחית את הרעש. כמות וירוס קלט נטרול צריכה להיקבע באופן כמותי מראש מן טיטרציה המקביל ואילו וירוסים ועדיין לשמור על מצב דומה. במהלך נטרול, התגובה antiserum לזיהום הוא מנורמל נגד ההבדל בין וירוס הפניה (VC) ורמת רקע (CC). מדידות מדויקות של VC ו CC חיוניים ניסוי הניטרול. עוד כפילויות מומלצות (שמונה כפילויות ששמשו נציג התוצאות). לבסוף, הבנת התוכנה היא חיונית להצלחה של ניסוי. התוכנה נבדקה לאפיון וירוס שיגרתי של מרכז שפעת WHO, בבריטניה במשך יותר משנים. הוראות מפורטות להתמודדות עם מצבים שונים מסופק S1 משלים.
assay MN זו מתאימה עבור יישומים בהם דגימות לכסות שלוחהשדה גדול remely המבט אלא רק דורשים רזולוציית הדמיה מתונה. העלות הנמוכה התקנה פשוטה להפוך את המערכת זמינה למעבדות וירולוגיה ביותר. הווריאציה במדידות של המדגם הזהה הייתה פחות מ -3%, אשר בערך מגדיר הוודאות הציגה במהלך הסריקה 11. שחזור כזה הוא מספיק במחקרי virological רבים ניתן להפחית עוד יותר על ידי ממוצעי תמונות מסריקות מרובות.
לסיכום, המחקר הנוכחי מדגים assay MN חזקים שניתן להשתמש בהם באופן שגרתי במחקר אנטיגני ולתמוך נתונים HI בניתוחים מפורט של כרגע-מחזורי נגיפי שפעת, בעיקר עבור הבחירה הדו-שנתי של וירוסים להכללה החיסונים לשפעת האדם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
