Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización
Summary
Este estudio describe una -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Micro-neutralización (MN) ensayos se utilizan en virología para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes y de las actividades antivirales. Como una alternativa de inhibición de la hemaglutinación (HI), ensayos de MN pueden superar los efectos no antigénicos influenciados por los cambios de afinidad de unión al receptor en los virus de influenza, que puede complicar la interpretación de los resultados de HI 1,2,3. Hasta hace poco, la mayoría de los ensayos de MN se basaron en los efectos citopáticos (CPE) o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) 4,5. MN ensayos basados en la reducción de enfoque y la placa se desarrollaron en 1990 6,7,8. ensayos de reducción de placas se basan en el recuento de placas visibles para cuantificar la infectividad. Sin embargo, los conteos visuales sólo cubren grandes placas que son resolubles por los ojos humanos, a pesar de que la mayoría de las placas son pequeños e invisibles para muchos virus circulantes actuales. Esta cobertura incompleta puede causar una variación significativa entre los examinadores y entre experimentos, lo que lleva a incomparable resultados. También es imposible utilizar el método cuando algunos virus muestran infección abortiva de células individuales o muy pequeñas placas.
La resolución de contaje pobre se puede mejorar mediante la introducción de un protocolo basado en formación de imágenes. Con los avances en la tecnología, microscopía óptica y de alto rendimiento de los lectores de placas bien pueden proporcionar medios precisos para contar las células infectadas 9. Bajo el microscopio trans-iluminación, las células infectadas etiquetados con ciertos marcadores pueden ser visualizados por su absorción o fluorescencia contraste en la resolución subcelular. Una muestra puede ser analizada en una pantalla de ordenador.
Desafortunadamente, debido a la limitación en el campo de vista, se requieren más de un centenar de imágenes en mosaico para cubrir un solo pozo. El análisis de una placa con 96 pozos requeriría la formación de imágenes y procesamiento de cerca de diez mil imágenes. Tal proceso laborioso es largo y costoso, y la resolución obtenida es en génerosl innecesario para la caracterización de rutina de infecciones virales. Laboratorios con un presupuesto limitado pueden encontrar que el enfoque en torno a un escáner de superficie plana ofrece una alternativa de alto rendimiento rentable.
En este trabajo se describe un ensayo de reducción de placas MN mejorado que es adecuado para la caracterización antigénica de un gran número de virus y para medir cuantitativamente las actividades antivirales y anticuerpos de neutralización. El ensayo tiene varias ventajas: en primer lugar, es un ensayo basado en formación de imágenes que es capaz de medir las infecciones de virus en el nivel celular, independientemente del tamaño de la placa. Contando la población total de células infectadas (ICP) dentro de un bien aumenta en gran medida la sensibilidad de detección, por lo que es posible caracterizar el virus con baja infectividad. En segundo lugar, una valoración cuantitativa más precisa se introduce antes de la neutralización para determinar la cantidad de virus de entrada. El virus de entrada cuantitativa reduce significativamente la variación entre los diferentes experimentos y hace que los resultados sean más comparables entre los laboratorios. En tercer lugar, los títulos de neutralización pueden determinarse directamente mediante el análisis de imágenes, por lo que la cuantificación rápida y fácil de usar. Por último, el protocolo ofrece una alternativa rentable y de alto rendimiento con la resolución y la precisión requerida. La cuantificación se basa en un escáner de superficie plana y software de procesamiento de datos libre. Todo el conjunto tiene un tamaño reducido y se puede implementar en la mayoría de los laboratorios.
El protocolo presentado en este documento consta de cuatro pasos importantes, incluyendo la titulación del virus, la cuantificación de titulación, la neutralización del virus, y la cuantificación de neutralización. Titulación del virus es un experimento de preparación que determina la cantidad de virus de entrada que se utilizará en la neutralización. Durante una titulación, una serie de concentraciones virales se aplican a las monocapas de células en una placa de 96 pocillos. Las células infectadas se cuantifican a continuación en la sección 2. El Dilu viralción que produce el 20% -85% ICP se aplica a su vez como virus de entrada correspondiente a la neutralización de 3. Los títulos de la sección del protocolo de neutralización se cuantifican utilizando la sección 4. Los experimentos que siguieron los protocolos anteriores se presentan en los resultados representativos. El ensayo ha sido probado a fondo durante los últimos dos años con la mayoría de los virus de la gripe que circulan corrientes, tales como A pdm09 (H1N1), A (H3N2), virus A y B. Los resultados de la caracterización virus de la gripe se incluyeron en los informes para la reunión de consulta de la OMS que dio recomendaciones sobre vacunas contra la gripe para su uso en el hemisferio sur en 2016 y en el Hemisferio Norte 2016-2017.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos descrito un ensayo de MN a base de formación de imágenes para cuantificar las verdaderas relaciones antigénicas entre los virus. En comparación con otros ensayos de reducción de placa, el método hace hincapié en la medición de la ICP de un bien todo, garantizar la cobertura completa de la población infecciosa. Su independencia de la formación de placa también se amplía la aplicación del ensayo a los virus que pueden formar pequeñas placas principalmente invisibles o que sólo pueden manejar la infección de una sola célula. Por lo tanto, el ensayo es capaz de examinar más virus y los efectos de una gama más amplia de anticuerpos que HI, y ayuda a reflejar de forma más exhaustiva las similitudes antigénicas o diferencias entre los virus 12. Por ejemplo, cuando se incluye carboxilato de oseltamivir, el ensayo de MN se ve menos afectada por NA unión dependiente, lo que refleja las diferencias antigénicas con más precisión. Durante el desarrollo del ensayo, se hicieron grandes esfuerzos para mejorar la consistencia experimento, la velocidad, y la detecciónsensibilidad, incluyendo mediante el control de los virus de entrada a través de la valoración cuantificada, de imágenes en un alto rendimiento con un escáner de superficie plana, y la implementación de una plataforma de procesamiento de datos fácil de usar. Los resultados han sido, en general consistentes con y confirmó las de HI. En particular, los resultados también revelaron diferencias antigénicas entre variantes de deriva antigénica de los virus recientes de tipo A y de la vacuna B, así como cambios antigénicos causados por los cambios de cultivo seleccionada o esporádicos, tales como la sustitución G155E en HA1 de ciertos (H1N1) virus pdm09 A 12.
El protocolo de juego con el tipo de virus o subtipo con la selección de líneas celulares que dieron la infección más fuerte, lo que permitió aumentar la señal de imagen. variación experimental se alisa con el diseño de duplicados que equilibrarse con el número de antisueros probado. Las incertidumbres también pueden provenir de la calidad de imagen, que está influenciada principalmente por el dispositivo de formación de imágenes. Una superficie plana de color del escáner decente puede signinificativamente mejorar el contraste de la imagen y reducir el ruido. La cantidad de virus de entrada en la neutralización debe ser determinado cuantitativamente por adelantado de la valoración correspondiente, mientras que los virus todavía mantienen un estado similar. Durante la neutralización, la respuesta a una infección antisuero se normaliza contra la diferencia entre el virus de referencia (VC) y el nivel de fondo (CC). Las mediciones precisas de VC y CC son esenciales para un experimento de neutralización. Se recomiendan más duplicados (ocho duplicados fueron utilizados en los resultados representativos). Por último, la comprensión de que el software es vital para el éxito de un experimento. El software ha sido probado para la caracterización del virus de la rutina en el Centro de la Gripe de la OMS, Reino Unido durante más de dos años. Las instrucciones detalladas para hacer frente a diversas situaciones se proporciona en el S1 complementario.
Este ensayo MN es adecuado para aplicaciones en las que las muestras cubren una extremely gran campo de vista, pero sólo requieren de imágenes de resolución moderada. El bajo costo y fácil instalación hacen que el sistema fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios de virología. La variación en las mediciones de la misma muestra fue de menos de 3%, que define aproximadamente la incertidumbre introducida durante la exploración 11. Tal reproducibilidad es suficiente en muchos estudios virológicos y puede reducirse aún más el promedio de las imágenes de varias exploraciones.
En conclusión, este estudio demuestra un ensayo de MN robusto que puede ser utilizado de forma rutinaria en estudio antigénico y para apoyar los datos HI de análisis detallados de virus de la gripe actualmente en circulación, en particular para la selección bianual de virus para su inclusión en las vacunas de la gripe humana.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
