Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu
Summary
Bu çalışma, bir açıklar görüntüleme bazlı mikro-nötralizasyon deneyi virüsler arasında antijenik ilişkileri analiz etmek. protokol düz yataklı tarayıcı kullanır ve titrasyon, titrasyon kantitatif, nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört adım vardır. Tahlil akımı dolaşan grip A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri ile iyi çalışır.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Mikro-nötrleştirme (MN) tahlilleri nötralize edici antikor miktarının belirlenmesi için ve antiviral etkinlikleri viroloji kullanılır. Hemaglutinasyon engellenmesinin bir alternatif olarak (HI) deneyleri, MN deneyleri HI yorumlanması 1,2,3 sonuçları karmaşıklaştırabilir reseptör bağlanma influenza virüsleri içinde afinite değişiklikler, etkilenmiş antijenik olmayan etkileri üstesinden gelebilir. Yakın zamana kadar, en çok MN deneyleri sitopatik etkiler (CPE) veya enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) 4,5 dayandırılmıştır. Odak ve plak azalmasına dayalı MN deneyleri 1990 6,7,8 geliştirilmiştir. Plak redüksiyon deneyleri enfektiviteyi ölçmek için görünür plaket sayma güveniyor. Ancak, görsel sayıları sadece plakların çoğunluğu küçük ve birçok güncel dolaşan virüs görünmez olsa, insan gözü tarafından çözülebilir olan büyük plaklar kapsamaktadır. Bu eksik kapsama i lider, sınav arasında ve deneyler arasında önemli varyasyon neden olabilirncomparable sonuçlanır. Bazı virüsler tek hücre ya da çok küçük plaklar başarısız enfeksiyon gösterdiğinizde yöntemi kullanmak da mümkün değildir.
fakir sayım çözünürlük, bir görüntüleme tabanlı protokol girişi ile geliştirilebilir. Teknoloji, optik mikroskop ve yüksek verimlilik gelişmeler ile iyi plaka okuyucu enfekte hücreleri 9 saymak doğru araç sağlayabilir. trans-aydınlatmalı mikroskobu altında belirli bir belirteç ile etiketlenmiş enfekte olmuş hücreler alt-hücresel çözünürlükte absorpsiyon veya floresan Buna karşılık görüntülenebilir. Bir numune, bir bilgisayar ekranı üzerinde analiz edilebilir.
Ne yazık ki, görüş alanı içinde sınırlama, yüzden fazla kiremitli görüntüleri tek bir kuyu kapağı için gereklidir. 96 çukurlu bir plaka analiz yaklaşık on bin görüntülerin görüntüleme ve işlem gerektirir. Bu zahmetli bir proses zaman alıcı ve pahalıdır ve elde edilen çözünürlük Cinslerviral enfeksiyonların rutin karakterizasyonu için gereksiz l. sınırlı bir bütçe ile laboratuvarlar bir masaüstü tarayıcı etrafında inşa yaklaşım maliyetli, yüksek hacimli bir alternatif sunuyor bulabilirsiniz.
Bu yazıda, virüs büyük bir sayıda antijenik karakterizasyonu için ve nicel olarak, antiviral aktiviteleri ve nötralizasyon antikorları ölçmek için uygun olan bir gelişmiş diştaşı azaltma MN deneyi tarif eder. Deney çeşitli avantajları vardır: ilk olarak, ne olursa olsun, plak boyutu, hücresel seviyede virüs enfeksiyonları ölçebilir bir görüntüleme bazlı deneyidir. iyi içinde toplam enfekte hücre popülasyonu (ICP) Sayma büyük ölçüde mümkün düşük enfeksiyon ile virüsleri karakterize etmek için yapım, algılama hassasiyetini artırır. İkinci olarak, daha kesin bir niceliksel titrasyonu, giriş virüsünün miktarını belirlemek için nötrleştirme öncesi ilave edilir. Kantitatif giriş virüsü anlamlı değişkenden azaltırFarklı deneyler arasındaki laboratuarlarında arasındaki sonuçlar daha karşılaştırılabilir hale getirir. Üçüncüsü, nötralizasyon titreleri, görüntüleri analiz hızlı kantitatif yapma ve kullanıcı dostu doğrudan belirlenebilir. Son olarak, protokol gerekli çözünürlük ve doğruluk ile düşük maliyetli ve yüksek verimli bir alternatif sunuyor. kantitatif bir flatbed tarayıcıya ve ücretsiz veri işleme yazılımı dayanmaktadır. Tüm kurulum küçük bir ayak izi vardır ve çoğu laboratuvarlarda konuşlandırılabilir.
Bu çalışmada sunulan protokol virüs titrasyon, titrasyon kantitatif, virüs nötralizasyon ve nötralizasyon kantitatif olmak üzere dört ana adımlardan oluşur. Virüs titrasyonu girişi virüs miktarı nötrleştirme kullanılacak belirleyen bir preparat denemedir. Bir titrasyon sırasında viral konsantrasyonları bir dizi 96 oyuklu bir plaka içerisinde, hücre mono tabakaları uygulanır. Enfekte hücreler daha sonra bölüm 2. Viral Dilu olarak nicelendirilir% 20-% 85 üretir tion ICP da karşılık gelen nötralizasyon giriş virüs olarak uygulanır bölüm 3. nötralizasyon protokolü titreleri bölüm yukarıdaki protokoller Temsilcisi Sonuçlar sunulmuştur ardından 4. Deneyleri kullanılarak ölçülür. Tahlil gibi A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B virüsleri gibi güncel dolaşan influenza virüsleri, çoğu ile son iki yılda iyice test edilmiştir. İnfluenza virüsü karakterizasyonu sonuçları 2016 yılında Güney Yarımküre ve 2016-2017 yılında Kuzey Yarımküre'de kullanılmak üzere influenza aşılarının önerileri verdi DSÖ istişare toplantısı için raporlara dahil edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, biz virüsler arasındaki gerçek antijenik ilişkileri ölçmek için bir görüntüleme bazlı MN deneyi nitelendirdi. diğer plak azaltma deneyleri ile karşılaştırıldığında, yöntem enfektif nüfusun tam kapsama sağlanması tüm kuyunun ICP ölçüm vurgulayan. plak oluşumunun bağımsızlığı da çoğunlukla görünmez küçük plaklar oluşturabilir ya da sadece tek hücreli enfeksiyonu yönetebilir virüslere karşı testinin uygulanmasını genişletmektedir. Bu nedenle, tahlil daha fazla virüs ve HI daha antikorların daha geniş etkilerini inceleyen yeteneğine sahiptir ve daha kapsamlı antijenik benzerlik ya da virüsler 12 arasındaki farklılıkları yansıtmak için yardımcı olur. Örneğin, oseltamivir karboksilat dahil edildiğinde, MN tahlil az daha doğru antijenik farklılıkları yansıtan, bağlayıcı NA-bağımlı etkilenir. Testin geliştirilmesi sırasında, büyük çabalar deney tutarlılık, hız ve algılama geliştirmek için yapılmıştırduyarlılık, bir masaüstü tarayıcı ile yüksek verimlilik olarak quantitated titrasyon, görüntüleme yoluyla giriş virüsleri kontrol ederek de dahil olmak üzere, ve kullanıcı dostu bir veri işleme platformu uygulanması. Sonuçlar genellikle ile tutarlı ve HI olanlar doğruladı. Özellikle, sonuçlar aynı zamanda belirli A (H1N1) pdm09 virüslerin HA1 içinde G155E ikamesi olarak kültür-seçilmiş veya sporadik değişikliklerin neden olduğu son tip A ve B aşı virüslerinin antijenik sürüklenme varyantları arasında antijenik farklılıklar yanı sıra antijenik değişiklikler, ortaya 12.
protokol büyük ölçüde görüntüleme sinyali gelişmiş güçlü enfeksiyon verdi hücre hatları seçimi ile virüs türü veya alt türü eşleşti. Deneysel varyasyon test antiserumlar sayısı ile dengeli çiftleri tasarımı ile düzeltti. Belirsizlikler de ağırlıklı görüntüleme cihazı etkilenir görüntü kalitesi, gelebilir. İyi bir renk flatbed tarayıcı signi olabilirficantly görüntü kontrastı artırmak ve gürültüyü azaltmak. virüsler hala benzer bir durumunu korumak ise nötralizasyon giriş virüs miktarı kantitatif ilgili titrasyon peşin tespit edilmelidir. Nötralizasyon sırasında bir enfeksiyona antiserum yanıt referans virüsü (VC) ve arka plan seviyesinin (CC) arasındaki farkın karşı normalize. VC ve CC hassas ölçümler bir nötralizasyon deneyinde için gereklidir. Daha çiftleri (sekiz çiftleri Temsilcisi Sonuçlar kullanılmıştır) tavsiye edilir. Son olarak, yazılım anlamak bir denemenin başarısı için hayati önem taşımaktadır. Yazılım iki yıldan fazla DSÖ İnfluenza Merkezi, İngiltere'de rutin virüs karakterizasyonu için test edilmiştir. Çeşitli durumlarla başa çıkmak için ayrıntılı talimatlar Ek S1 sağlanır.
Bu MN deney örnekleri bir dahili kapak uygulamalar için uygundurremely büyük görüş alanı ama sadece orta görüntüleme çözünürlüğü gerektirir. düşük maliyetli ve basit kurulum en viroloji laboratuvarlarında sistem hazır olun. Aynı numunenin ölçümleri varyasyon yaklaşık tarama sırasında 11 kişiye belirsizliği tanımlayan en az% 3 olmuştur. Bu tekrarlanabilirlik birçok viral çalışmalarında yeterli olduğu ve daha çok taramaları görüntü ortalama azaltılabilir.
Sonuç olarak, bu çalışma rutin antijenik çalışmada kullanılabilir ve özellikle, insan influenza aşıları dahil virüslerin iki yılda bir seçimi için, influenza virüs şu anda dolaşan detaylı analizler HI verileri desteklemek için sağlam bir MN deneyi gösterir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
