Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay
Summary
Questo studio descrive un di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Micro-neutralizzazione (MN) saggi sono utilizzati in virologia per la determinazione quantitativa di anticorpi neutralizzanti e di attività antivirale. Come alternativa di inibizione emoagglutinazione (HI) saggi, saggi MN in grado di superare gli effetti non antigeniche influenzati dai cambiamenti di affinità di recettoriale in virus influenzali, che possono complicare l'interpretazione dei risultati HI 1,2,3. Fino a poco tempo, la maggior parte dei saggi di MN sono stati basati su effetti citopatico (CPE) o metodica immunoenzimatica (ELISA) 4,5. Saggi MN basate sulla riduzione della messa a fuoco e la placca sono stati sviluppati nel 1990 6,7,8. saggi di riduzione delle placche si basano sul conteggio targhe visibili da quantificare infettività. Tuttavia, conta visive coprono solo grandi placche che sono risolvibile occhi umani, anche se la maggior parte delle placche sono piccole e invisibili per molti virus che circolano correnti. Questa copertura incompleta può causare variazioni significative tra gli esaminatori e tra gli esperimenti, che porta a Irisultati ncomparable. È anche possibile utilizzare il metodo quando alcuni virus mostrano infezione abortiva di singole cellule o molto piccole placche.
La risoluzione poveri conteggio può essere migliorata con l'introduzione di un protocollo di imaging basata. Con i progressi della tecnologia, la microscopia ottica e high-throughput lettori ben piastre in grado di fornire i mezzi precisi per contare le cellule infette 9. Sotto un microscopio trans-illuminato, cellule infettate taggati con alcuni marcatori possono essere visualizzati con il loro assorbimento o fluorescenza contrasto con risoluzione sub-cellulare. Un campione può essere quindi analizzato sullo schermo del computer.
Sfortunatamente, a causa della limitazione del campo di vista, più di cento immagini affiancate necessari per coprire un singolo pozzo. Analizzando una piastra con 96 pozzetti richiederebbe l'immagine e l'elaborazione di circa diecimila immagini. Tale processo laborioso è lunga e costosa, e la risoluzione acquisita è nei generil inutili per la caratterizzazione di routine delle infezioni virali. Laboratori con un budget limitato possono trovare che l'approccio costruito intorno uno scanner piano prevede un costo-efficacia, high-throughput alternativa.
In questo articolo, descriviamo un test MN riduzione delle placche perfezionato che è adatto per la caratterizzazione antigenica di un gran numero di virus e per misurare quantitativamente attività antivirali e anticorpi di neutralizzazione. Il test ha diversi vantaggi: in primo luogo, si tratta di un test di imaging-based che è in grado di misurare infezioni da virus a livello cellulare, indipendentemente dalle dimensioni della placca. Contando la popolazione cellulare infettata totale (ICP) all'interno di un pozzo aumenta notevolmente la sensibilità di rilevamento, rendendo possibile caratterizzare i virus a bassa infettività. In secondo luogo, una titolazione quantitativa più accurata è introdotto prima della neutralizzazione per determinare la quantità di virus in ingresso. Il virus di ingresso quantitativa riduce significativamente il variazione tra i diversi esperimenti e rende i risultati più comparabili tra laboratori. In terzo luogo, titoli di neutralizzazione possono essere determinati direttamente analizzando le immagini, rendendo la quantificazione rapida e user-friendly. Infine, il protocollo prevede un costo-efficacia e high-throughput alternativa con la risoluzione e la precisione richiesta. La quantificazione è basata su uno scanner piano e software di elaborazione dati libera. L'intero setup ha un ingombro ridotto ed è implementabile nella maggior parte dei laboratori.
Il protocollo presentato in questo documento si compone di quattro fasi principali, tra cui titolazione del virus, la titolazione quantificazione, neutralizzazione del virus, e la neutralizzazione quantificazione. Virus titolazione è un esperimento preparazione che determina la quantità di virus in ingresso da utilizzare in neutralizzazione. Durante una titolazione, un numero di concentrazioni virali sono applicati ai monostrati di cellule in una piastra da 96 pozzetti. Le cellule infette sono poi quantificati nella sezione 2. La diluizione viralezione che produce il 20% -85% ICP viene a sua volta applicato come virus di ingresso alla neutralizzazione corrispondente sezione 3. I titoli del protocollo di neutralizzazione vengono quantificati utilizzando la sezione 4. Gli esperimenti che hanno seguito i protocolli di cui sopra sono presentati nelle Rappresentante dei risultati. Il test è stato testato a fondo nel corso degli ultimi due anni con la maggior parte degli attuali virus influenzali circolanti, come A (H1N1) pdm09, A (H3N2), e virus B. I risultati della caratterizzazione virus dell'influenza sono stati inclusi nelle relazioni per la riunione di consultazione dell'OMS che ha dato dei consigli su vaccini antinfluenzali per l'uso nel sud del mondo nel 2016 e nell'emisfero settentrionale nel 2016-2017.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo descritto un test MN di imaging-based per quantificare i veri rapporti tra antigeniche dei virus. Rispetto ad altri saggi placca di riduzione, il metodo sottolinea misurando la ICP di un'intera bene, garantendo la completa copertura della popolazione infettivo. L'indipendenza di formazione della placca allarga anche l'applicazione del test di virus che possono formare piccole placche prevalentemente invisibili o che può gestire solo infezione singola cellula. Pertanto, l'analisi è in grado di esaminare più virus e gli effetti di una più ampia gamma di anticorpi diversi da HI, e aiuta a riflettere in modo più completo le somiglianze antigeniche o differenze tra virus 12. Ad esempio, quando oseltamivir carbossilato è incluso, il saggio MN è meno influenzata da NA-legame dipendente, riflettendo le differenze antigeniche più accurato. Durante lo sviluppo del test, grandi sforzi sono stati fatti per migliorare la consistenza esperimento, velocità e rilevamentosensibilità, anche a controllare i virus di ingresso attraverso la titolazione quantificato, immagini in alta produttività con uno scanner piano, e l'implementazione di una piattaforma di elaborazione dei dati di facile utilizzo. I risultati sono stati generalmente in linea con e confermato quelli di HI. In particolare, i risultati hanno inoltre rivelato differenze antigeniche tra varianti deriva antigenica dei recenti virus di tipo A e di vaccini B, così come i cambiamenti antigenici causati da cambiamenti di cultura-selezionato o sporadici, come ad esempio la sostituzione G155E in HA1 di alcuni (H1N1) virus pdm09 A 12.
Il protocollo ha trovato il tipo di virus o sottotipo con la selezione di linee cellulari che hanno dato l'infezione più forte, che ha notevolmente migliorato il segnale di imaging. variazione sperimentale è stata lisciata con la progettazione di duplicati che bilanciato con il numero di antisieri testato. Incertezze possono anche venire dalla qualità delle immagini, che è principalmente influenzata dal dispositivo di imaging. Un colore flatbed scanner decente può significantly migliorare il contrasto dell'immagine e ridurre il rumore. La quantità di virus in ingresso nella neutralizzazione deve essere determinata quantitativamente in anticipo dal corrispondente titolazione mentre i virus ancora mantengono uno stato simile. Durante la neutralizzazione, la risposta antisiero un'infezione è normalizzata contro la differenza tra il virus di riferimento (VC) e il livello di fondo (CC). Misure accurate di VC e CC sono essenziali per un esperimento di neutralizzazione. Più duplicati sono raccomandati (otto duplicati sono stati utilizzati nelle Rappresentante dei risultati). Infine, la comprensione del software è di vitale importanza per il successo di un esperimento. Il software è stato testato per la caratterizzazione del virus di routine nella Influenza Centro OMS, Regno Unito per più di due anni. Istruzioni dettagliate per affrontare varie situazioni è previsto nella S1 supplementare.
Questo test MN è adatta per applicazioni in cui i campioni coprono un extremely ampio campo di vista, ma solo richiedono Resolution Imaging moderata. Il basso costo e la configurazione semplice rendono il sistema facilmente disponibile alla maggior parte dei laboratori di virologia. La variazione misurazioni dello stesso campione era inferiore al 3%, che definisce circa l'incertezza introdotta durante la scansione 11. Tale riproducibilità è sufficiente in molti studi virologici e può essere ulteriormente ridotto media immagini da più scansioni.
In conclusione, questo studio dimostra un test MN robusto che può essere utilizzato di routine nello studio antigenica e per sostenere i dati HI in analisi dettagliate delle attualmente in circolazione virus influenzali, in particolare per la selezione biennale dei virus per l'inclusione in vaccini antinfluenzali umani.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
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