L'optimisation d'un micro-neutralisation quantitative de dosage
Summary
Cette étude décrit un à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Micro-neutralisation (MN), les dosages sont utilisés en virologie pour le dosage d'anticorps neutralisants et des activités antivirales. Comme une alternative d'inhibition de l' hémagglutination (HI) des essais, des essais de MN peuvent surmonter les effets non-antigéniques influencés par les changements d'affinité de liaison aux récepteurs de virus de la grippe, ce qui peut compliquer l'interprétation des résultats de HI 1,2,3. Jusqu'à récemment, la plupart des essais de MN ont été basées sur des effets cytopathiques (CPE) ou des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) 4,5. Essais MN basé sur la réduction de la concentration et la plaque ont été développés en 1990 6,7,8. des dosages de réduction de plaque reposent sur le comptage des plaques visibles pour quantifier l'infectivité. Cependant, les chiffres visuels ne couvrent que les grandes plaques qui sont résoluble par des yeux humains, même si la majorité des plaques sont petites et invisibles pour de nombreux virus circulant actuels. Cette couverture incomplète peut provoquer des variations importantes entre les examinateurs et entre les expériences, conduisant à iRésultats ncomparable. Il est également impossible d'utiliser la méthode lorsque certains virus montrent infection abortive de cellules individuelles ou de très petites plaques.
La résolution de comptage pauvre peut être améliorée par la mise en place d'un protocole basé sur l'imagerie. Avec les progrès de la technologie, la microscopie optique et à haut débit lecteurs bien-plaques peuvent fournir des moyens précis pour compter les cellules infectées 9. Sous un microscope trans-éclairé, les cellules infectées marqués avec certains marqueurs peuvent être visualisés par leur absorption ou de fluorescence contraste dans la résolution sub-cellulaire. Un échantillon peut ensuite être analysé sur un écran d'ordinateur.
Malheureusement, en raison de la limitation dans le champ de vision, plus d'une centaine d'images carrelés sont nécessaires pour couvrir un seul puits. L'analyse d'une plaque de 96 puits nécessiterait l'imagerie et le traitement d'une dizaine de milliers d'images. Un tel processus laborieux est longue et coûteuse, et la résolution est acquise dans les genresl inutile pour la caractérisation de routine des infections virales. Laboratoires avec un budget limité peuvent constater que l'approche construite autour d'un scanner à plat fournit un, à haut débit alternative rentable.
Dans cet article, on décrit une amélioration de dosage MN réduction de plaque qui est appropriée pour la caractérisation antigénique d'un grand nombre de virus et pour mesurer quantitativement les activités antivirales et les anticorps de neutralisation. Le dosage présente plusieurs avantages: d'une part, il est un essai basé sur l'imagerie, qui est capable de mesurer les infections virales au niveau cellulaire, quelle que soit la taille de la plaque. Le comptage de la population cellulaire totale infectée (PCI) à l'intérieur d'un puits augmente considérablement la sensibilité de détection, permettant ainsi de caractériser les virus à faible infectivité. D'autre part, un dosage quantitatif plus précis est introduit avant la neutralisation afin de déterminer la quantité de virus d'entrée. Le virus quantitative d'entrée réduit de manière significative le variation entre les différentes expériences et rend les résultats plus comparables entre les laboratoires. Troisièmement, les titres de neutralisation peuvent être déterminés directement par l'analyse des images, ce qui rend la quantification rapide et facile à utiliser. Enfin, le protocole fournit une alternative rentable et à haut débit avec la résolution et la précision requise. La quantification est basée sur un scanner à plat et le logiciel libre de traitement de données. La configuration entière a un faible encombrement et est déployable dans la plupart des laboratoires.
Le protocole présenté dans le présent document se compose de quatre étapes principales, y compris le titrage du virus, le titrage de quantification, la neutralisation du virus, et la neutralisation quantification. Titrage du virus est une expérience de préparation qui détermine la quantité de virus d'entrée à utiliser dans la neutralisation. Au cours d'un titrage, un certain nombre de concentrations virales sont appliquées sur les monocouches de cellules dans une plaque à 96 puits. Les cellules infectées sont ensuite quantifiées dans la section 2. La dilu viraletion qui produit 20% -85% PCI est à son tour appliqué en tant que virus d'entrée pour la neutralisation correspondante section 3. Les titres du protocole de neutralisation sont quantifiés en utilisant la section 4. Les expériences qui ont suivi les protocoles ci-dessus sont présentés dans les résultats représentatifs. L'essai a été testé à fond au cours des deux dernières années avec la plupart des virus grippaux circulants actuels, tels que A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B. Les résultats de la caractérisation des virus de la grippe ont été inclus dans les rapports de la réunion de consultation de l'OMS qui a donné des recommandations sur les vaccins contre la grippe pour une utilisation dans l'hémisphère Sud en 2016 et l'hémisphère Nord en 2016-2017.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons décrit un essai à base de MN de formation d'images pour quantifier les relations réelles entre les antigènes des virus. Par rapport à d'autres essais plaque de réduction, la méthode met l'accent sur la mesure de l'ICP de l'ensemble d'un puits, d'assurer la couverture complète de la population infectieuse. Son indépendance de la formation de plaques élargit également l'application de l'analyse des virus qui peuvent former de petites plaques essentiellement invisibles ou qui ne peuvent gérer l'infection à cellule unique. Par conséquent, le dosage est capable d'examiner plus de virus et les effets d'une plus large gamme d'anticorps que HI, et il aide à réfléchir de façon plus complète les similitudes ou les différences entre les virus 12 antigéniques. Par exemple, lorsque le carboxylate d'oseltamivir est inclus, le dosage de la MN est moins affecté par la liaison NA-dépendante, ce qui reflète les différences antigéniques avec plus de précision. Au cours du développement du dosage, de grands efforts ont été faits pour améliorer l'uniformité de l'expérience, la vitesse et la détectionsensibilité, y compris en contrôlant les virus d'entrée par titration quantifiée, imagerie à haut débit avec un scanner à plat, et mettre en œuvre une plate-forme de traitement de données conviviale. Les résultats ont été généralement conformes et confirmé ceux de HI. Notamment, les résultats ont également révélé des différences antigéniques entre les variantes de dérive antigénique des virus récents de type A et vaccin B, ainsi que des changements antigéniques causés par la culture sélectionnée ou sporadiques changements, tels que la substitution de G155E en HA1 de certains (H1N1) virus A de pdm09 12.
Le protocole correspond au type ou sous-type du virus de la sélection des lignées cellulaires qui ont donné l'infection la plus forte, ce qui a grandement amélioré le signal d'imagerie. variation expérimentale a été lissée à la conception des doublons qui balance avec le nombre d'antiserums testés. Les incertitudes peuvent également provenir de la qualité d'image, qui est principalement influencée par le dispositif d'imagerie. Une couleur scanner à plat décent peut signitivement améliorer le contraste de l'image et de réduire le bruit. La quantité de virus d'entrée dans la neutralisation doit être déterminée quantitativement à l'avance de la titration correspondante tandis que les virus conservent encore un statut similaire. Lors de la neutralisation, la réaction de l'antisérum à une infection est normalisée sur la différence entre le virus de référence (VC) et le niveau d'arrière-plan (CC). Des mesures précises de VC et CC sont essentiels à une expérience de neutralisation. Plus de doublons sont recommandés (huit doublons ont été utilisés dans les résultats représentatifs). Enfin, la compréhension du logiciel est essentielle à la réussite d'une expérience. Le logiciel a été testé pour la caractérisation des virus de routine dans le Centre de la grippe de l'OMS, au Royaume-Uni depuis plus de deux ans. Les instructions détaillées pour faire face à diverses situations est fourni dans le S1 supplémentaire.
Cet essai de MN est adapté pour des applications où les échantillons couvrent un posteremely grand champ de vision, mais ne nécessitent que la résolution d'imagerie modérée. Le faible coût et de configuration simple rendent le système facilement accessible à la plupart des laboratoires de virologie. La variation des mesures du même échantillon était inférieure à 3%, ce qui définit à peu près l'incertitude introduite au cours du balayage 11. Cette reproductibilité est suffisante dans de nombreuses études virologiques et peut encore être réduit en faisant la moyenne des images à partir de plusieurs scans.
En conclusion, cette étude démontre un essai de MN robuste qui peut être utilisée en routine dans l'étude antigénique et de soutenir des données HI dans des analyses détaillées de ce moment-virus grippaux en circulation, notamment pour la sélection bisannuelle des virus pour l'inclusion dans les vaccins de la grippe humaine.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
