Оптимизация количественного микро-анализ нейтрализации
Summary
Это исследование описывает формирования изображения на основе микро-нейтрализации анализа для анализа антигенные взаимосвязи между вирусами. Протокол использует планшетный сканер и имеет четыре шага, включая титрование, титрование количественному, обезвреживанию и нейтрализации количественному. Анализ хорошо работает с текущей циркулирующие вирусы гриппа A (H1N1) pdm09, A (H3N2) и вирусы B.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Микро-нейтрализации (MN) Анализы используются в вирусологии для количественного определения нейтрализующих антител и противовирусной активности. В качестве альтернативы ингибирования гемагглютинации (HI) анализы, анализы MN может преодолеть без антигенных эффектов под влиянием изменения сродства рецептора-связывания в вирусов гриппа, которые могут осложнить интерпретацию результатов HI 1,2,3. До недавнего времени большинство MN анализы были основаны на цитопатического эффекта (CPE) или иммуноферментного анализа (ELISA) 4,5. Были разработаны MN анализы , основанные на фокус и бляшки сокращения в 1990 году 6,7,8. Зубной налет Анализы сокращения полагаются на подсчете видимых бляшек для количественной оценки инфекционности. Тем не менее, визуальный подсчет только покрывают большие бляшки, которые разрешимы человеческим глазом, хотя большинство бляшек маленькие и невидимые для многих современных циркулирующих вирусов. Это неполный охват может вызвать значительное изменение среди экзаменаторов и между экспериментами, что приводит к Incomparable результаты. Также невозможно использовать метод, когда некоторые вирусы показывают неудачную инфекции одиночных клеток или очень маленьких бляшек.
Плохое разрешение подсчета может быть улучшена за счет введения протокола формирования изображения на основе. С развитием технологий, оптической микроскопии и высокой пропускной способностью читатели хорошо пластины могут обеспечить точные средства для подсчета инфицированных клеток 9. Под транс-освещенная микроскопом, инфицированные клетки с тэгом определенными маркерами могут быть визуализированы с помощью их поглощения или флуоресценции в отличие от субклеточном разрешения. Образец может быть проанализирован на экране компьютера.
К сожалению, в связи с ограничением в поле зрения, более ста плиточные изображения должны покрывать одну скважину. Анализируя пластину с 96 лунок потребует обработки изображений и обработки около десяти тысяч изображений. Такой трудоемкий процесс занимает много времени и дорого, а разрешение получили в родахл ненужной для рутинной характеризации вирусных инфекций. Лаборатории с ограниченным бюджетом могут обнаружить, что подход построен вокруг планшетного сканера обеспечивает рентабельное, высокую пропускную способность альтернативу.
В этой статье мы опишем улучшенный MN анализ уменьшения образования зубного налета, который подходит для антигенной характеристики большого количества вирусов и для количественного измерения противовирусной активности и нейтрализации антител. Анализ имеет несколько преимуществ: во-первых, она представляет собой анализ изображений на основе, который способен измерять вирусные инфекции на клеточном уровне, независимо от размера бляшки. Подсчет общего зараженную популяцию клеток (ПМС) в скважине значительно повышает чувствительность обнаружения, что позволяет охарактеризовать вирусы с низкой инфекционности. Во-вторых, более точное количественное титрование вводится до нейтрализации с целью определения количества вируса ввода. Вирус количественный ввод значительно снижает Variaция между различными экспериментами и делает результаты более сопоставимы между лабораториями. В-третьих, нейтрализующие титры антител можно определить непосредственно путем анализа изображений, что делает быстро и количественно оценивать удобно. Наконец, протокол обеспечивает рентабельную и высокой пропускной способностью вариант с требуемой разрешающей способности и точности. Количественное основан на планшете сканера и свободного программного обеспечения для обработки данных. Вся установка имеет небольшой размер и может быть развернуто в большинстве лабораторий.
Протокол, представленные в этой статье, состоит из четырех основных этапов, в том числе титрования вируса, титрование количественному, нейтрализации вируса и нейтрализации количественному. Вирус титрование представляет собой препарат эксперимент, который определяет количество входных вирусов, которые будут использоваться в нейтрализации. Во время титрования, ряд вирусных концентраций, применяются к монослоев клеток в 96-луночный планшет. Инфицированные клетки затем количественному в разделе 2. Вирусный diluции, который производит 20% -85% ПМС, в свою очередь применяется в качестве входных вирусов к соответствующей нейтрализации в Раздел 3. Титры протокола нейтрализации количественно, используя раздел 4. Эксперименты, которые следовали вышеуказанные протоколы представлены в представительных результатов. Анализ был тщательно протестирован в течение последних двух лет с большинства современных вирусов гриппа, циркулирующих, таких как A (H1N1) pdm09, A (H3N2) и вирусы B. Результаты определения характеристик вируса гриппа были включены в доклады для консультативного совещания ВОЗ, которая дала рекомендации в отношении вакцин против гриппа для использования в Южном полушарии в 2016 году и в северном полушарии в 2016-2017 гг.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном исследовании мы описали формирования изображения на основе анализа MN, чтобы количественно оценить истинные антигенные отношения между вирусами. По сравнению с другими анализов доска снижение, метод измерения делает акцент ПМС целой скважины, обеспечивая полный охват инфекционном населения. Его независимость образования бляшек также расширяет применение анализа на вирусы, которые могут образовывать в основном невидимые маленькие бляшки или которые могут управлять только инфекцией одноклеточных. Таким образом, анализ способен изучения больше вирусов и эффектов более широкого спектра антител , чем HI, и это помогает более полно отражать антигенные сходства или различий между вирусами 12. Например, когда озельтамивир карбоксилат включен, анализ МН менее подвержена воздействию НС-зависимое связывание, что отражает антигенные различия более точно. Во время разработки анализа, были сделаны большие усилия для повышения согласованности эксперимента, скорость и обнаружениечувствительность, в том числе путем контроля входных вирусов через титрования, количественно изображения в высокой пропускной способности с помощью планшетного сканера, а также реализует удобную платформу для обработки данных. Результаты, как правило, согласуются с результатами и подтвердили те HI. Следует отметить, что результаты также показали антигенные различия между антигенных вариантов дрейфа последних вирусов типа А и вакцины B, а также антигенные изменения, вызванные культуры отобранных или спорадических изменений, таких как замена G155E в ГА1 некоторых A (H1N1) вирусов pdm09 12.
Протокол соответствовал тип вируса или подтип с выбором клеточных линий, которые дали самую сильную инфекцию, что значительно повысило сигнал формирования изображения. Экспериментальное изменение сглаживали с конструкцией дубликатами, что сбалансированное с числом протестированных сывороток. Неопределенности могут также исходить от качества изображения, которое в основном зависит от устройства формирования изображения. Приличное цветной планшетный сканер может Significantly улучшить контраст изображения и снизить уровень шума. Количество вируса в входного нейтрализации должна быть количественно определена заранее из соответствующего титрования в то время как вирусы по-прежнему поддерживать одинаковый статус. В процессе нейтрализации, реакция антисыворотки к инфекции нормализована по отношению к разнице между контрольным вирусом (VC) и фонового уровня (CC). Точные измерения VC и CC имеют важное значение для нейтрализации эксперимента. Более дубликатами рекомендуется (восемь дубликатами были использованы в представительных результатов). И, наконец, понимание программного обеспечения имеет жизненно важное значение для успеха эксперимента. Программное обеспечение было протестировано для рутинной характеризации вирусов в центр по гриппу ВОЗ, Великобритания в течение более двух лет. Подробные инструкции по работе с различными ситуациями предусмотрено в дополнительном S1.
Этот MN анализ подходит для применений, где образцы покрывают собой добremely большое поле зрения, но требуют лишь умеренного разрешения изображения. Низкая стоимость и простота установки делают систему доступной для большинства вирусологических лабораториях. Разброс измерений одного и того же образца составляла менее 3%, что примерно определяет неопределенности , вводимой во время сканирования 11. Такая воспроизводимости достаточно во многих исследованиях вирусологии и может быть дополнительно уменьшена путем усреднения изображений с использованием нескольких циклов сканирования.
В заключение, данное исследование демонстрирует надежный анализ MN, который может быть широко используется при антигенной исследовании и поддерживать данные HI в детальном анализе в настоящее время циркулирующих вирусов гриппа, в частности, за два раза в год отбора вирусов для включения в вакцины гриппа человека.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
- Walker, D. L., Horsfall, F. L. Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses. J Exp Med. 91, 65-86 (1950).
- Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes. Virology. 289, 74-85 (2001).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment. J Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection. J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).
- Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays. J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).
- Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system. J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).
- Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro. J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J. 3, 63-70 (2006).
- Comley, J. High content screening – Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis. Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).
- Lin, Y. P., et al. Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).
