Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização
Summary
Este estudo descreve uma -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.
Abstract
The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.
Introduction
Micro-neutralização (Mn) Os ensaios são usados em virologia para a quantificação de anticorpos neutralizantes e de actividades antivirais. Como uma alternativa de inibição da hemaglutinação (Hl) ensaios, ensaios de MN pode superar os efeitos não-antigénicos influenciadas pelas mudanças de afinidade de receptor de ligação ao vírus da gripe, em que podem complicar a interpretação dos resultados 1,2,3 HI. Até recentemente, a maioria dos ensaios de MN foram baseados em efeitos citopáticos (CPE) ou ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA) de 4,5. Ensaios MN com base na redução de foco e placas foram desenvolvidas em 1990 6,7,8. Ensaios de redução de placas confiar em contar placas visíveis para quantificar a infecciosidade. No entanto, contagens visuais só cobrir grandes placas que são resolvido pelo olho humano, mesmo que a maioria das placas são pequenos e invisível para muitos vírus corrente circulante. Esta cobertura incompleta pode causar uma variação significativa entre os examinadores e entre experimentos, levando a iresultados ncomparable. É também possível usar o método em que alguns vírus mostrar infecção abortiva de células individuais ou muito pequenas placas.
A resolução de contagem pobre pode ser melhorada através da introdução de um protocolo baseado em imagiologia. Com os avanços da tecnologia, microscopia óptica e de alto rendimento leitores bem-placa pode fornecer meio preciso para contar as células infectadas 9. Sob um microscópio trans-iluminado, as células infectadas marcadas com certos marcadores podem ser visualizados por sua absorção ou fluorescência contraste na resolução de sub-celular. Uma amostra pode, então, ser analisadas num ecrã de computador.
Infelizmente, devido à limitação no campo de vista, mais do que uma centena de imagens em azulejo são necessários para cobrir um único poço. Analisando uma placa com 96 poços exigiria a criação de imagens e processamento de cerca de dez mil imagens. Tal processo é trabalhoso e demorado, caro, e a resolução obtida é em génerosl desnecessária para a caracterização de rotina de infecções virais. Laboratórios com um orçamento limitado pode achar que a abordagem construído em torno de um scanner de mesa oferece uma alternativa de alto rendimento rentável.
Neste artigo, descreve-se um ensaio de redução de placas MN melhorada que é adequado para a caracterização antigénica de um grande número de vírus e para medir quantitativamente as actividades antivirais e anticorpos de neutralização. O ensaio tem várias vantagens: em primeiro lugar, é um ensaio à base de imagens, que é capaz de medir a infecções por vírus a nível celular, independentemente do tamanho da placa. Contando da população total de células infectadas (ICP) dentro de um bem aumenta grandemente a sensibilidade de detecção, que permitem caracterizar os vírus com baixa infectividade. Em segundo lugar, uma titulação quantitativa mais preciso é introduzido antes da neutralização para determinar a quantidade de vírus de entrada. O vírus de entrada quantitativa reduz significativamente o Variação entre as diferentes experiências e torna os resultados mais comparáveis entre laboratórios. Em terceiro lugar, os títulos de neutralização pode ser determinada directamente através da análise de imagens, tornando a quantificação rápida e fácil de usar. Finalmente, o protocolo fornece uma alternativa de baixo custo e de alto rendimento com a resolução e precisão necessária. A quantificação é baseada em um scanner de mesa e software de processamento de dados livre. Toda a configuração tem uma pegada pequena e pode ser implantado na maioria dos laboratórios.
O protocolo apresentado neste documento consiste em quatro etapas principais, incluindo titulação do vírus, a quantificação de titulação, a neutralização do vírus, e quantificação de neutralização. titulação do vírus é um experimento de preparação que determina a quantidade de vírus de entrada a serem usados na neutralização. Durante a titulação, uma série de concentrações virais são aplicados às monocamadas de células numa placa de 96 poços. As células infectadas são então quantificados na seção 2. O Dilu viralção, que produz 20% -85% ICP é, por sua vez aplicada como vírus de entrada para a neutralização correspondente no Seção 3. Os títulos do protocolo de neutralização são quantificados usando seção 4. As experiências que se seguiram os protocolos acima são apresentados nos resultados representativos. O ensaio foi testado exaustivamente durante os últimos dois anos, com a maior parte das correntes que circulam os vírus da gripe, tais como A (H1N1) pdm09, A (H3N2), e B vírus. Os resultados da caracterização do vírus da gripe foram incluídos nos relatórios para a reunião de consulta da OMS, que deu recomendações sobre vacinas contra a gripe para uso no Hemisfério Sul em 2016 e do Hemisfério Norte em 2016-2017.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, descrevemos um ensaio MN baseada em imagem para quantificar as verdadeiras relações antigênicas entre vírus. Em comparação com outros ensaios de redução da placa, o método de medição enfatiza o ICP de um poço inteiro, assegurando a cobertura completa da população infecciosa. A independência da formação de placas também se alarga a aplicação do ensaio de vírus que podem formar pequenas placas essencialmente invisíveis ou que só pode controlar a infecção de uma única célula. Portanto, o ensaio é capaz de examinar mais vírus e os efeitos de uma ampla gama de anticorpos do que HI, e que ajuda a reflectir de forma mais abrangente as semelhanças ou diferenças entre os vírus 12 antigênicas. Por exemplo, quando carboxilato de oseltamivir está incluído, o ensaio MN é menos afectado pela NA-ligação dependente, refletindo as diferenças antigênicas com mais precisão. Durante o desenvolvimento do ensaio, foram feitos grandes esforços para melhorar a consistência experimento, a velocidade, e a detecçãosensibilidade, inclusive por meio do controle de vírus de entrada através de titulação quantificada, imagens em alto rendimento com um scanner de mesa, e implementação de uma plataforma de processamento de dados user-friendly. Os resultados têm sido geralmente consistente com e confirmou os da HI. Notavelmente, os resultados também revelaram diferenças antigênicas entre variantes de deriva antigênicas dos vírus recentes do tipo A e vacinas B, assim como as mudanças antigênicas causadas por mudanças selecionadas de cultura ou esporádicos, como a substituição G155E em HA1 de certas (H1N1) vírus pdm09 A 12.
O protocolo combinava com o vírus tipo ou subtipo com a selecção de linhas celulares que deram a infecção mais forte, que melhorou substancialmente o sinal de imagem. variação experimental foi alisado com o design de duplicados que em relação com o número de anti-soros testados. Incertezas também pode vir de a qualidade da imagem, que é influenciado principalmente pelo dispositivo de imagem. Uma cor scanner de mesa decente pode signivamente melhorar o contraste de imagem e reduzir o ruído. A quantidade de vírus de entrada na neutralização deve ser quantitativamente determinado previamente a partir da titulação correspondente enquanto os vírus ainda manter um estado semelhante. Durante a neutralização, a resposta anti-soro a uma infecção é normalizada contra a diferença entre o vírus de referência (VC) e o nível de fundo (CC). medições precisas de VC e CC são essenciais para uma experiência de neutralização. Mais duplicatas são recomendados (oito duplicatas foram utilizados nos resultados representativos). Finalmente, compreendendo o software é vital para o sucesso de uma experiência. O software foi testado para a caracterização do vírus de rotina no Centro de Influenza da OMS, Reino Unido por mais de dois anos. As instruções detalhadas para o tratamento de várias situações é fornecido no S1 suplementar.
Este ensaio de manganês é adequado para aplicações em que as amostras cobrem uma extgrande campo remely de vista, mas só exigem resolução de imagem moderada. O baixo custo ea configuração simples tornar o sistema prontamente disponível para a maioria dos laboratórios de virologia. A variação nas medidas de uma mesma amostra foi inferior a 3%, ou menos, que define a incerteza introduzida durante o varrimento 11. Tal reprodutibilidade é suficiente em muitos estudos virológicos e pode ser ainda mais reduzida pela média imagens de vários exames.
Em conclusão, este estudo demonstra um ensaio MN robusto que pode ser utilizado rotineiramente em estudo antigênica e para suportar dados HI em análises detalhadas de vírus da gripe actualmente em circulação, nomeadamente para a seleção semestral do vírus para inclusão em vacinas contra a gripe humana.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.
Materials
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving. |
| 2XDMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10ml/plate): | 5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell – 5ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v) |
| Horse serum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80 |
| Mouse MAb against influenza type A | Biorad | MCA 400 | 1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate | Biorad | 172-1011 | 2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer |
| True Blu peroxidase substrate | KPL | 50-78-02 | Substrate: True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution) |
| 96-well flat-bottom microtitre plates | Costar | 3596 | |
| 8 channel multiwall-plate washer and manifold | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads. |
| Software operational environment: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window based with NI Vision builder | Version: LabVIEW2012 or above |
References
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