라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
생리 활성 소분자 근본적 셀과 상호 작용하는 하나 이상의 "대상"분자, 가장 일반적으로 단백질의 기능을 변경함으로써 작동한다. 약물 발견에 때 활성 화합물 표현형 선별을 통해 발견되고, 그 화합물의 분자량이 타겟 (들)의 식별은 작용 화합물의 잠재적 부작용의 메커니즘을 이해뿐만 아니라 대한 잠재적으로 발견되지 중요 새로운 생물학 질병 모델을 기본 및 치료제 (1)의 새로운 기계적인 클래스의 개발을위한 방법을 포장. 목표 식별이 치료에 사용하고자하는 약물이 필요하지 않지만, 최근에는 신약 후보 검증 대상이 알려진 경우보다 투자 수익률을 수득 때문에 임상 시험에 성공하고, 가능성이 있음을 점점 인식되고있다 2. 따라서, 작은 식별하는 방법에 대한 관심이 증가되고있다분자 표적 단백질.
고전 목표 식별 실험은 일반적으로 관심의 작은 분자는 수지상에 고정화 비 결합 단백질을 씻어, 나머지 단백질 용출 3를 식별 한 후, 전체 세포 용 해물과 배양 친 화성 정제에 의존한다. 이 기술은 여러 개의 작은 분자들 (4)의 타겟을 식별하기 위해 사용되었지만, 여러 가지 이유로, 범용 대상 ID 방법으로 적합하지 않다. 먼저, 표적 단백질은 작은 분자에 결합하는 능력을 유지하기 위해 세포 용해시의 기본 형태를 유지해야한다. 이것은 종종 그들의 네이티브 환경에서 제거 된 후 구조적인 변화를 거쳐, 또는 단순히 집계 및 용액으로부터 침전 막 단백질, 특히 문제가 될 수 있습니다. 유지하면서 두 번째로, 작은 분자는 화학적으로는 수지에 고정화 될 수있는 방식으로 수정해야표적 단백질에 결합 할 수있는 능력. 이 수지에 고정되면 깊은 결합 포켓 따라서 작은 분자에 액세스 할 수 없게 될 수 있습니다. 셋째, 결합 친화력은 상호 작용이 어려운 낮은 친화력 상호 작용을 확인하기가 세정 단계 동안 유지되도록 충분히 높아야한다. 등의 pH, 이온 농도, 또는 다른 내인성 분자의 존재 넷째, 환경 조건은 셀 내의 공간적으로 다양하고 때로는 약물 표적 상호 작용을 전제되어있다. 따라서, 허용 시행 착오 상당량 필요로 할 수있는 셀의 외부 결합 유지하도록 적절한 조건을 찾아 내기.
Photoaffinity 라벨링 소분자와 셀의 기본 문맥 내에서 타겟의 공유 결합을 허용함으로써 이러한 문제를 회피. 오히려 부피가 큰 수지 소분자 고정화보다 분자 대신 두 개의 작은 화학적 작용 g을 설치하도록 수정roups : 빛의 특정 파장의 조사 대상의 단백질에 공유 결합 가교를 할 수있는 광활성 부위 및 표적 단백질을 검출하고이어서 분리 할 수있는 리포터 기. 생균 프로브가 공유 결합하여 표적 단백질에 가교 및 프로브 단백질 복합체는 절연 그대로 상기 photoaffinity 프로브로 처리된다. 표적에 결합하는 프로브의 특이성은 모 화합물의 과량의 표적 단백질로 프로브의 결합 거리 경쟁하는 데 사용되는 병렬로 경쟁 실험을 수행함으로써 입증된다.
photoaffinity 프로브의 설계 및 합성은 하나의 작은 분자에서 다른 매우 다양하고,이 프로토콜에 포함되지 않습니다; 그러나, 주제에 대한 몇 가지 훌륭한 토론 5-9을 발표했다. 주요 고려 presumab 따라서, 프로브는 모 화합물의 생물학적 활성을 유지한다는 것이다LY는 동일한 타겟 (들)에 대한 결합. 구조 활성 관계 (SAR) 시험은 분자의 일부가 생체 활성의 상실없이 변형 될 수 있는지 결정하기 위해 수행되어야한다. 다른 화학 그룹이 다양한 각각의 장단점이 10 diazirine 페논, 아릴 아 지드를 포함 광활성 가교제,로서 사용되어왔다. 마찬가지로, 프로브 – 결합 단백질을 분리하는 데 사용 된 여러 리포터 태그가있다. 리포터 그룹은 일반적으로 사용되는 바이오틴 또는 형광 태그와 같은 자신의 기능 일 수 있고, 이하와 생체 활성 (11)을 손상하는 것이 어려울 수 있다는 장점을 가지고있는 광 가교 공정과, 이후 상기 작용을 필요 전구체 일 수있다.
이 프로토콜에서, 우리는 diazirine의 광 가교기를 함유하는 photoaffinity 프로브, 및 구리 (I)을 통해 리포터 그룹의 부착 말단 알킨 -catalyz을 사용한에드 아 지드 – 알킨 샤프 – Hüisgen의 사이클로 (또는 클릭) 반응 12-15. 은 SAR 연구, 설계 및 합성을 조사하고, 이러한 연구의 결과는 다른 곳에서 16-18 발표되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
약물의 세포 표현형가 알려진 기능에 따라 잠재적 인 대상을 좁힐하는 데 사용되는 하향식, 또는 상향식 (bottom-up), 대상 : 작은 분자의 목표를 확인하는 다른 방법은 크게 두 가지 범주로 분류 할 수 있습니다 화학 물질 또는 유전 적 수단 (3)에 의해 직접적으로 식별됩니다. 하향식 또는 표현형 연구 약물의 영향을 특정 세포 프로세스를 식별 할 수있다 (예를 들면, 전사 / 번역 / DNA ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
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