Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
Biyoaktif küçük moleküller temelde hücre içinde, ile etkileşim ve bir ya da daha fazla "hedef" moleküller, en çok protein fonksiyonunu değiştirerek çalışır. ilaç keşfi, ne, bir aktif bileşik fenotipik tarama yoluyla tespit edilir, bu bileşiğin moleküler hedef (ler) in tespiti, sadece hareket ve bileşik potansiyel yan etkilerinin mekanizmasının anlaşılması, değil, aynı zamanda potansiyel olarak keşfetmek olmayan, son derece önemlidir yeni biyoloji hastalık modelin altında yatan ve terapötik 1 yeni mekanistik sınıfların gelişmesi için önünü açtı. hedef tanımlama terapötik kullanılacak bir ilaç için gerekli olmasa da, son yıllarda yeni ilaç adayları geçerli bir hedef bilinen ise, daha iyi yatırım getiri nedenle klinik çalışmalarda başarılı ve daha muhtemel olduğunu artan bir tanıma olmuştur 2. Böylece, küçük belirlemek için yöntemler artan bir ilgi olmuşturmolekül hedef proteinler.
Klasik bir hedef belirleme deneyi tipik haliyle ilgi küçük molekül, bir reçine üzerine immobilize ve bağlanmamış protein yıkanarak ve geri kalan proteinler elüt edilmekte ve 3 tespit edilir, sonra bütün hücre lizatları ile kuluçkalanır afinite saflaştırma dayanır. Bu teknik, çok sayıda küçük moleküller 4 hedeflerini tanımlamak için kullanılmış olsa da, bazı nedenlerle, evrensel bir hedef kimliği yöntem için uygun değildir. İlk olarak, hedef proteinin küçük moleküllü bağlanma yeteneğini muhafaza etmek için, hücre lizizi sonrasında doğal yapısını muhafaza etmelidir. Bu genellikle, doğal ortamından ayrılmış sonra yapı değişimlerine uğrama, ya da sadece agrega ve solüsyonun dışında çökelmesi membran proteinleri için, özellikle sorun yaratabilir. korurken İkinci olarak, küçük molekül kimyasal olarak reçine üzerine immobilize edilebilir bir şekilde değiştirilmesi gerekirHedef protein bağlanma yeteneğidir. Bu reçineye giderildikten sonra derin bağlanma cepleri nedenle küçük moleküle erişilemez olabilir. Üçüncü olarak, bağlanma afinitesi etkileşimi zor düşük afinite etkileşimler kimlik verme, yıkama adımları sırasında korunur şekilde yeterince yüksek olması gerekmektedir. pH, iyon konsantrasyonu veya diğer endojen moleküllerin varlığı gibi Dördüncü, çevre koşulları hücre içinde mekansal değişir ve bazen ilaç hedef etkileşimleri için de önkoşul olabilir. Böylece, izin ve deneme yanılma önemli miktarda gerektirebilir hücrenin dışında bağlayıcı korumak için doğru koşulların bulunması.
Fotoafinite işaretleme küçük bir molekülün bir hücrenin doğal kapsamında hedefinin kovalent izin vererek bu sorunları circumvents. Aksine büyük bir hantal reçine küçük molekül immobilize daha molekül yerine kimyasal iki küçük fonksiyonel g yüklemek için modifiye edilirroups: belirli bir ışık dalga boyuna sahip ışınlanmış olduğunda hedef proteine kovalent çapraz bağlanmasını sağlayan bir foto-aktifleştirilebilen kısım, ve hedef proteinin algılanabilir ve daha sonra izole sağlayan bir raportör grubu yer alır. Canlı hücreler, prob bağlanmakta ve kovalent hedef proteine çapraz bağlayan ve prob-protein kompleksi daha sonra izole bozulmamış, fotoafinite probu ile tedavi edilir. hedefe bağlanabilen prob özgünlüğü ana bileşiğin fazla bir hedef proteine probun bağlanması uzaklıkta rekabet için kullanılan paralel bir rekabet deneyi gerçekleştirmek gösterilmiştir.
fotoafinite prob tasarımı ve sentezi küçük bir molekülün diğerine büyük ölçüde değişir ve bu protokolde kapsamında değildir; Ancak, konuyla ilgili çeşitli mükemmel tartışmalar 5-9 yayınlandı. ana dikkate presumab nedenle prob ana bileşiğin biyolojik etkinliğini muhafaza etmesidirly Aynı hedef (ler) e bağlandığı görülmüştür. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları molekülün parçaları biyo kaybı olmadan değiştirilebilir belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Farklı kimyasal grupların çeşitli avantajları ve dezavantajları 10 sahip diazirine, benzofenon ve aril azit içeren ışıkla çapraz bağlayıcı, olarak kullanıldı. Benzer şekilde, prob bağlayıcı proteinler izole etmek için kullanılmıştır birçok muhabir etiketleri bulunmaktadır. Raportör grupları gibi yaygın olarak kullanılan biyotin veya flüoresan etiketler olarak, kendi işlevsel olabilir, ya da daha küçük ve biyolojik aktivite 11 tehlikeye böylece daha az muhtemel olması avantajına sahiptir foto-çapraz adım sonraki daha işlevselleştirilmesini gerektiren ön olabilir.
Bu protokol, bir foto-çapraz diazirine grubu içeren bir fotoafinite sonda ve bir Cu (I) ile bir raportör grubunun eklenmesi için bir terminal alkin -catalyz kullandıked Azid-Alkin Kansız-Hüsgen Siklokatılma (veya tıklayın) reaksiyon 12-15. SAR çalışmaları, tasarım ve sentez soruşturma ve bu çalışmaların sonuçları yerde 16-18 yayınlandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
İlacın hücresel fenotip onların bilinen fonksiyonları dayalı potansiyel hedefleri daraltmak için kullanılan yukarıdan aşağıya, ya da aşağıdan yukarıya, hedef: küçük moleküllerin hedefleri belirlenmesi için farklı yaklaşımlar genel olarak iki kategoride toplanabilir kimyasal veya genetik yollarla 3 doğrudan tanımlanır. Yukarıdan-aşağıya veya fenotipik çalışmalar ilacın etkilenen bazı hücresel süreçleri tanımlamak (örneğin, transkripsiyon / çeviri / DNA sentez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
