Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
de petites molécules bioactives fonctionnent fondamentalement par interaction avec et en modifiant la fonction d'une ou plusieurs molécules "cibles", le plus souvent des protéines dans la cellule. Dans la découverte de médicaments, quand un composé actif est découvert par le dépistage phénotypique, l'identification de la cible moléculaire (s) de ce composé est crucial, non seulement pour comprendre le mécanisme d'action et les effets secondaires potentiels du composé, mais aussi pour éventuellement découvrir nouvelle biologie sous – tend le modèle de la maladie et ouvrant la voie pour le développement de nouvelles classes mécanistiques de la thérapeutique 1. Bien que l'identification des cibles est pas nécessaire pour un médicament à être utilisé en thérapeutique, ces dernières années, il y a eu une reconnaissance croissante que les nouveaux médicaments candidats sont plus susceptibles de réussir dans les essais cliniques, et donc d'obtenir de meilleurs rendements sur investissement, si une cible validée est connue 2. Ainsi, il y a eu un intérêt croissant pour les méthodes d'identification des petitsprotéines cibles molécule.
Une expérience d'identification de cible classique repose généralement sur la purification par affinité, où la petite molécule d'intérêt est immobilisée sur une résine et mis en incubation avec des lysats de cellules entières, après quoi les protéines non liées sont éliminées par lavage et les protéines restantes sont éluées et identifiés 3. Bien que cette technique a été utilisée pour identifier les cibles de nombreuses petites molécules 4, il ne convient pas comme procédé d'identification cible universelle pour plusieurs raisons. Tout d'abord, la protéine cible doit conserver sa conformation native lors de la lyse cellulaire, afin de conserver sa capacité à se lier à la petite molécule. Cela peut être particulièrement problématique pour les protéines membranaires, qui subissent souvent des changements conformationnels après avoir été retiré de son environnement d'origine, ou simplement d'agrégats et précipitent hors de la solution. D'autre part, la petite molécule doit être chimiquement modifiée de façon à ce qu'il puisse être immobilisé sur la résine tout en conservantsa capacité à se lier à la protéine cible. poches de liaison profondes peuvent donc devenir inaccessibles à une petite molécule, une fois qu'il est fixé à la résine. En troisième lieu, l'affinité de liaison doit être suffisamment élevée pour que l'interaction soit maintenue pendant les étapes de lavage, ce qui rend l'identification des interactions d'affinité inférieurs difficiles. En quatrième lieu, les conditions environnementales telles que le pH, la concentration d'ions, ou la présence d'autres molécules endogènes peuvent varier dans l'espace intérieur de la cellule et sont parfois des conditions préalables pour les interactions médicament-cible. Ainsi, trouver les bonnes conditions pour permettre et maintenir l'extérieur de la cellule de liaison peut nécessiter une quantité importante d'essais et d'erreurs.
Marquage photoaffinité évite ces problèmes en permettant la liaison d'une petite molécule et sa cible dans le contexte natif d'une cellule covalente. Plutôt que immobilisant la petite molécule dans une large résine volumineux, la molécule est plutôt modifiée chimiquement pour installer deux petits g fonctionnelleroupes: un groupement photoactivable qui permet une réticulation covalente à la protéine cible lors de l'irradiation avec une longueur d'onde particulière de la lumière, et un groupe rapporteur qui permet à la protéine cible à détecter et ensuite isolé. Les cellules vivantes sont traitées avec la sonde de photoaffinité, la sonde se lie de manière covalente et la réticulation de la protéine cible et le complexe sonde-protéine est ensuite isolée intacte. La spécificité de liaison à la cible sonde est mise en évidence en réalisant une expérience de compétition en parallèle, où un excès du composé parent est utilisé pour concourir à une distance de liaison de la sonde à la protéine cible.
La conception et la synthèse des sondes de photoaffinité varie considérablement d'une petite molécule à l'autre, et ne seront pas couverts par ce protocole; cependant, plusieurs excellentes discussions sur le sujet ont été publiés 5-9. La considération principale est que la sonde conserve l'activité biologique du composé parent, par conséquent presumabment de liaison à la même cible (s). Relation structure-activité (SAR) des études doivent être effectuées pour déterminer quelles parties de la molécule peuvent être modifiés sans perte de bioactivité. Une variété de différents groupes chimiques ont été utilisés comme agents de reticulation, y compris photoactivables diazirine, la benzophénone, l' azide et aryle, qui présentent chacune des avantages et des inconvénients 10. De même, il y a plusieurs étiquettes de reporteurs qui ont été utilisées pour isoler des protéines de liaison à la sonde. Les groupes rapporteurs peuvent être fonctionnels eux – mêmes, tels que la biotine couramment utilisés ou des marqueurs fluorescents, ou peuvent être des précurseurs qui nécessitent une fonctionnalisation supplémentaire postérieure à l'étape de photoréticulation, qui ont l'avantage d'être plus petite et donc moins susceptibles de compromettre l' activité biologique 11.
Dans ce protocole, nous avons utilisé une sonde de photoaffinité contenant un groupe diazirine de photoréticulation et un alcyne terminal pour la fixation d'un groupe reporter par un Cu (I) -catalyzed Azide-Acétylène Sharpless-Huisgen cycloaddition (ou cliquez) Réaction 12-15. Les études SAR, sonder la conception et la synthèse, et les résultats de ces études ont été publiés ailleurs 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différentes approches de l'identification des cibles de petites molécules peuvent être regroupées en deux catégories: de haut en bas, où le phénotype cellulaire du médicament est utilisé pour affiner ses cibles potentielles en fonction de leurs fonctions connues, ou bottom-up, où la cible est identifié directement par voie chimique ou génétique 3. Top-down ou les études phénotypiques peuvent identifier certains processus cellulaires affectés par le médicament (par exemple, la tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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