L'identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

piccole molecole bioattive fondamentalmente funzionano interagendo ed alterare la funzione di uno o più molecole "target", più comunemente proteine, nella cellula. In scoperta di farmaci, quando un composto attivo viene scoperto attraverso lo screening fenotipico, identificazione del bersaglio molecolare (s) di detto composto è cruciale, non solo per la comprensione del meccanismo di azione e potenziali effetti collaterali del composto, ma anche per potenzialmente scoprire nuova biologia alla base del modello di malattia e aprendo la strada allo sviluppo di nuove classi meccanicistiche terapie in ^1. Anche se l'identificazione di destinazione non è richiesta per un farmaco da utilizzare terapeuticamente, negli ultimi anni c'è stato un crescente riconoscimento del fatto che nuovi farmaci candidati hanno maggiori probabilità di avere successo negli studi clinici, e quindi produrre rendimenti migliori degli investimenti, se un bersaglio convalidato è noto ^2. Così, c'è stato un crescente interesse metodi per identificare piccoleproteine ​​bersaglio molecola.

Un esperimento di identificazione di destinazione classica si basa in genere su purificazione di affinità, dove la piccola molecola di interesse è immobilizzato su una resina e incubato con lisati cellulari integrali, dopo di che le proteine ​​non legate vengono spazzati via e le restanti proteine ​​vengono eluite e identificati ^3. Sebbene questa tecnica è stata utilizzata per identificare i bersagli di molte piccole molecole ^4, è idoneo come metodo ID destinazione universale per diversi motivi. Innanzitutto, la proteina bersaglio deve mantenere la sua conformazione nativa upon lisi cellulare al fine di mantenere la sua capacità di legarsi alla piccola molecola. Questo può essere particolarmente problematico per proteine ​​di membrana, che spesso subiscono cambiamenti conformazionali dopo essere stato rimosso dal loro ambiente nativo, o semplicemente aggregata e precipitano dalla soluzione. In secondo luogo, la piccola molecola deve essere modificata chimicamente in modo tale che esso può essere immobilizzato sulla resina mantenendosua capacità di legare la proteina bersaglio. tasche vincolanti profondi possono pertanto diventare inaccessibile a una piccola molecola una volta che è fissato alla resina. In terzo luogo, l'affinità di legame deve essere sufficientemente elevata che l'interazione viene mantenuta durante le fasi di lavaggio, rendendo l'identificazione delle interazioni minore affinità impegnativi. Quarto, condizioni ambientali, quali pH, concentrazione di ioni, o la presenza di altre molecole endogene possono variare spazialmente all'interno della cellula e sono talvolta prerequisiti per interazioni farmaco-bersaglio. Così, trovare le condizioni corrette per consentire e mantenere al di fuori della cellula legame può richiedere una quantità significativa di tentativi ed errori.

etichettatura Photoaffinity elude questi problemi, consentendo il legame di una piccola molecola e il suo obiettivo nel contesto nativo di una cellula covalente. Invece di immobilizzare la piccola molecola ad una grande resina ingombrante, la molecola viene invece modificato chimicamente installare due piccoli g funzionaliruppi: un residuo fotoattivabile che permette covalente reticolazione alla proteina bersaglio quando irradiato con una particolare lunghezza d'onda della luce, e un gruppo giornalista che permette la proteina bersaglio da rilevare e successivamente isolato. cellule vive sono trattati con la sonda photoaffinity, la sonda si lega covalentemente e reticola alla proteina bersaglio, e il complesso sonda proteina è poi isolato intatto. La specificità di legame al bersaglio sonda è dimostrata effettuando un esperimento di competizione in parallelo, dove un eccesso del composto originario è utilizzato per competere via legame della sonda alla proteina bersaglio.

La progettazione e la sintesi di sonde photoaffinity varia notevolmente da una piccola molecola ad un altro, e non saranno coperti in questo protocollo; tuttavia, diversi ottimi discussioni sul tema sono stati pubblicati ^5-9. La considerazione principale è che la sonda mantiene la bioattività del composto originario, quindi presumabmente vincolante per la stessa destinazione (s). Relazione struttura-attività (SAR) studi devono essere effettuati per determinare quali parti della molecola possono essere modificate senza perdita di bioattività. Una varietà di diversi gruppi chimici sono stati utilizzati come reticolanti fotoattivabile, tra diazirine, benzofenone, e aril azide, che hanno ciascuno vantaggi e svantaggi ^10. Inoltre, ci sono più tag giornalista che sono stati utilizzati per isolare proteine ​​sonda vincolante. Gruppi Reporter possono essere funzionale da soli, come la biotina comunemente usato o tag fluorescenti, o possono essere precursori che richiedono ulteriori funzionalizzazione successivamente alla fase photocrosslinking, che hanno il vantaggio di essere più piccolo e quindi meno probabilità di compromettere bioattività ^11.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato una sonda photoaffinity contenente un gruppo diazirine photocrosslinking, e un alchino terminale per il fissaggio di un gruppo giornalista attraverso un Cu (I) -catalyzEd azide-Acetilene Sharpless-Huisgen cicloaddizione (o click) reazione di ^12-15. Gli studi SAR, sonda progettazione e sintesi, e risultati di questi studi sono stati pubblicati altrove ^16-18.