ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
生物活性小分子は、基本的に、細胞内で相互作用し、1つ以上の「標的」分子は、最も一般的にタンパク質の機能を変化させることにより動作します。活性化合物は、表現型スクリーニングによって発見されたときに薬物の発見では、その化合物の分子標的（複数可）の同定は作用機序および化合物の潜在的な副作用を理解するためだけでなく、潜在的に発見するためだけではなく、非常に重要です新しい生物学疾患モデルの基礎となると治療1の新たな機構的なクラスの開発のための道を開きます。標的の同定は、治療に使用する薬剤のために必要とされていないが、近年では、検証対象が既知であれば、新規薬剤候補は、臨床試験に成功し、そのための投資でより良いリターンをもたらす可能性がより高いことを増加の認識がありました2。したがって、小さな同定するための方法に関心がありました分子標的タンパク質。
古典的な標的の同定実験は、典型的には、対象の小分子は、樹脂上に固定化され、非結合タンパク質が洗い流され、残りのタンパク質が溶出し、3を識別された後、全細胞溶解物とともにインキュベートされるアフィニティー精製に依存しています。この技術は、多くの小分子4の標的を同定するために使用されているが、それはいくつかの理由のためにユニバーサルターゲットID方式としては不向きです。まず、標的タンパク質は、小分子に結合する能力を保持するために、細胞溶解の際に、その天然のコンフォメーションを保持しなければなりません。これは、多くの場合、それらの天然の環境から取り出された後、コンフォメーション変化を受ける、または単に凝集し、溶液から沈殿する膜タンパク質のために特に問題となり得ます。第二に、小分子は、化学的に維持しながら、樹脂に固定化することができるように修正されなければなりません標的タンパク質に結合する能力。それを樹脂に固定された後ディープ結合ポケットは、したがって、小分子にアクセスできなくなる可能性があります。第三に、結合親和性は、相互作用が低い親和性相互作用の識別が困難に、洗浄工程の間に維持されていることを十分に高くなければなりません。第四に、例えば、pH、イオン濃度、または他の内因性分子の存在などの環境条件は、細胞内で空間的に変化させることができ、そして時には薬物 – 標的相互作用のための前提条件です。したがって、許可および細胞外の結合を維持するための正しい条件を見つけることは試行錯誤のかなりの量を必要とすることができます。
光親和性標識は、小分子と細胞の天然コンテキスト内でその目標の共有結合を可能にすることにより、これらの問題を回避します。むしろ大きなかさばる樹脂への小分子を固定化するよりも、分子ではなく、化学的に二つの小さな機能グラムをインストールするように修正されますroups：特定の波長の光を照射すると、標的タンパク質に共有結合架橋を可能にする光活性成分、および標的タンパク質が検出され、続いて単離することができ、レポーター基。生細胞は、プローブが結合し、共有結合標的タンパク質に架橋し、プローブ – タンパク質複合体を単離し、無傷で、光親和性プローブで処理されます。標的に結合するプローブの特異性は、親化合物の過剰が、標的タンパク質に対するプローブの結合離れて競合するために使用される並列で競合実験を行うことにより実証されます。
光親和性プローブの設計と合成は1、小分子から別のものに大きく変化し、このプロトコルではカバーされません。しかし、件名にいくつかの優れた議論が5-9を公開されています。主な考慮事項はpresumab従って、プローブは、親化合物の生物活性を保持することですLY同じ対象（複数可）に結合します。構造活性相関（SAR）研究は、分子の部分は生物活性の損失なしに変更することができるかを決定するために実行されなければなりません。別の化学基の種々は、それぞれ長所と短所10を有しているジアジリン、ベンゾフェノンおよびアリールアジドを含む光活性架橋剤として使用されてきました。同様に、プローブの結合タンパク質を単離するために使用されている複数のレポータータグがあります。レポーター基は、一般的に使用されるビオチンまたは蛍光タグのように、自分で機能的であってもよいし、小さく、生物活性11を危うくすることがにくいという利点を有する光架橋工程の後にさらなる官能化を必要とする前駆体であってもよいです。
このプロトコルでは、我々は、Cu（I）-catalyz介しジアジリンの光架橋基を含有する光親和性プローブ、およびレポーター基の結合のための末端アルキンを使用していますEDアジド-アルキンシャープレス-ヒュイゲンの環（またはクリック）反応12-15。 SAR研究、プローブ設計と合成、およびこれらの研究の結果は、他の場所で16-18を発表されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
薬剤の細胞表現型は、それらの既知の機能に基づいて、その潜在的なターゲットを絞り込むために使用されるトップダウン、またはボトムアップ、ターゲット：小分子の標的を同定するために、異なるアプローチは、大きく二つのカテゴリーに分類することができます化学的または遺伝的手段3によって直接識別されます。トップダウンまたは表現型の研究では、小分子の究極の表現?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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