Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
Биоактивные малые молекулы, в основном работают путем взаимодействия с и изменения функции одной или более "целевых" молекул, чаще всего белков, в клетке. Во время обнаружения наркотиков, когда активное соединение обнаруживается через фенотипического скрининга, определение молекулярной мишени (ов) этого соединения имеет решающее значение не только для понимания механизма действия и возможных побочных эффектов соединения, но и для потенциально обнаружения новая биология , лежащая в основе модели болезни и прокладывает путь для разработки новых механистических классов терапевтических средств 1. Хотя идентификация цели не требуется для лекарственного средства для использования в терапевтических целях, в последние годы наблюдается все более широкое признание, что новые кандидаты наркотиков больше шансов на успех в клинических испытаниях, и, следовательно, дают более высокую прибыль от инвестиций, если подтверждено целевой известно 2. Таким образом, наблюдается растущий интерес к методам выявления небольшоймолекулы белков-мишеней.
Классическим идентификация эксперимента мишень обычно опирается на аффинной очистки, где малая молекула представляет интерес иммобилизуют на смоле и инкубировали с лизатов целых клеток, после чего несвязанных белков вымываются , а остальные белки элюируют и идентифицированы 3. Хотя этот метод был использован для определения целей многих малых молекул 4, она непригодна в качестве универсального метода целевой ID по нескольким причинам. Во-первых, белок-мишень должен сохранять свою нативную конформацию после лизиса клеток для того, чтобы сохранить свою способность связываться с малой молекулой. Это может быть особенно проблематичным для мембранных белков, которые часто подвергаются конформационные изменения после удаления из их родной среды, или просто агрегировать и выпадать в осадок из раствора. Во-вторых, малая молекула должна быть химически модифицированы таким образом, что он может быть иммобилизован на смолу, сохраняя при этомего способность связываться белок-мишень. Поэтому глубокие связывающие карманы могут стать недоступными для небольшой молекулы, как только она крепится к смоле. В-третьих, аффинность связывания должно быть достаточно высоким, что взаимодействие поддерживается в течение этапов промывки, что делает идентификацию более низкое сродство взаимодействий сложных. В-четвертых, условия окружающей среды, таких как рН, концентрации ионов, или при наличии других эндогенных молекул могут изменяться в пространстве внутри клетки и являются иногда предпосылками наркотиков целевых взаимодействий. Таким образом, нахождение правильных условий для обеспечения и поддержания связывания вне клетки может потребовать значительного количества проб и ошибок.
Фотоаффинное мечение обходит эти проблемы, позволяя ковалентную связь маленькой молекулы и его мишенью в нативной контексте клетки. Вместо того, чтобы иммобилизацию небольшую молекулу с большой громоздкой смолой, молекула вместо химически модифицированы, чтобы установить два небольших функциональный гroups: а Фотоактивируемая фрагмент, который позволяет ковалентного сшивания с белком-мишенью при облучении с определенной длиной волны света, а репортер группа, которая позволяет целевой белок, чтобы быть обнаружены и затем выделяют. Живые клетки обрабатывают с фотоаффинной зондом, зонд связывается и ковалентно сшивает с белком-мишенью, и зонд-белковый комплекс, затем выделяют нетронутым. Специфичность зонда связывания с мишенью демонстрируется путем проведения эксперимента конкуренции параллельно, где избыток исходного соединения, который используется, чтобы конкурировать в сторону связывания зонда с белком-мишенью.
Конструкция и синтез фотоаффинной зондов сильно варьируется от одной маленькой молекулы к другой, и не будет рассматриваться в этом протоколе; Тем не менее, несколько отличных дискуссий по этому вопросу были опубликованы 5-9. Основным фактором является то, что зонд сохраняет биологическую активность исходного соединения, поэтому presumabLY привязки к той же цели (ов). Отношения структура-активность (SAR) исследования должны быть выполнены, чтобы определить, какие части молекулы могут быть изменены без потери биологической активности. Множество различных химических групп , которые были использованы в качестве сшивающих агентов фотоактивируемых, в том числе diazirine, бензофенон и арил азид, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки 10. Кроме того, есть несколько тегов репортер, которые были использованы для изоляции зонд-связывающих белков. Репортерные группы могут быть функциональными сами по себе, такие как обычно используемые биотином или флуоресцентных меток, или могут быть предшественниками , которые требуют дальнейшей функционализации после стадии фотосшивки, которые имеют преимущество быть меньше и , таким образом , менее вероятно , к компромиссу биоактивность 11.
В этом протоколе, мы использовали фотоаффинной зонд, содержащий diazirine фотосшивающих группу и терминала алкина для присоединения репортерной группы через Cu (I) -catalyzред Azide-алкине Шарплесс-Hüisgen циклоприсоединения (или щелчок) реакция 12-15. Исследования SAR, зондировать дизайн и синтез, и результаты этих исследований были опубликованы в другом месте 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные подходы к определению целевых малых молекул могут быть широко сгруппированы в две категории: сверху вниз, где клеточный фенотип препарат используется, чтобы сузить свои потенциальные цели на основе их известных функций, или снизу вверх, где целевая идентифицируется непосре?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
