تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تعمل بشكل أساسي من خلال التفاعل مع وتغيير وظيفة من جزيئات واحدة أو أكثر "الهدف"، والأكثر شيوعا البروتينات في الخلية. في اكتشاف المخدرات، عندما تم اكتشاف مركب نشط من خلال الفحص المظهري، وتحديد الهدف الجزيئي (ق) من هذا المركب أمر بالغ الأهمية، ليس فقط لفهم آلية عمل والآثار الجانبية المحتملة للمركب، ولكن أيضا بسبب احتمال اكتشاف الاحياء الجديدة التي يقوم عليها نموذج المرض ويمهد الطريق لتطوير الطبقات الآلية الجديدة من العلاجات 1. على الرغم من أن ليس مطلوبا تحديد الهدف لعقار لاستخدامها علاجيا، كان هناك اعتراف متزايد في السنوات الأخيرة أن المرشحين المخدرات الرواية هي أكثر احتمالا للنجاح في التجارب السريرية، وبالتالي يحقق عائدا أفضل على الاستثمار، وإذا كان الهدف التحقق من صحة معروف 2. وهكذا، فقد كان هناك اهتمام متزايد في طرق لتحديد صغيرةجزيء البروتين الهدف.
هدف التجربة تحديد الكلاسيكية يعتمد عادة على تنقية تقارب، حيث ثبتوا جزيء صغير من الفائدة على الراتنج وحضنت مع لست] خلية كاملة، وبعد ذلك يتم غسلها البروتينات غير منضم بعيدا ومزال البروتينات المتبقية وتحديد 3. في حين تم استخدام هذه التقنية لتحديد الأهداف من العديد من الجزيئات الصغيرة 4، فإنه غير مناسب كوسيلة معرف الهدف الشامل لعدة أسباب. أولا، يجب أن البروتين المستهدف تحتفظ التشكل الأصلي الخاص به على تحلل الخلية من أجل الحفاظ على قدرتها على ربط جزيء صغير. هذا يمكن أن يكون مشكلة خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء، والتي غالبا ما تخضع لتغيرات متعلق بتكوين بعد إزالة من بيئتهم المحلية، أو ببساطة مجموع المباراتين وتترسب من الحل. ثانيا، جزيء صغير يجب أن يتم تعديل كيميائيا في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن يجمد على الراتنج مع الحفاظ علىقدرته على ربط البروتين المستهدف. وبالتالي قد تصبح جيوب ملزمة عميقة غير قابلة للوصول إلى جزيء صغير مرة واحدة فهي ثابتة إلى الراتنج. ثالثا، يجب أن يكون تقارب ملزمة عالية بما فيه الكفاية أن يتم الحفاظ على التفاعل خلال خطوات الغسيل، مما يجعل تحديد أقل التفاعلات تقارب الصعبة. والظروف البيئية الرابعة مثل درجة الحموضة، تركيز أيون، أو وجود جزيئات الذاتية الأخرى يمكن أن تختلف مكانيا داخل الخلية وفي بعض الأحيان المتطلبات الأساسية لالتفاعلات الهدف المخدرات. وهكذا، وإيجاد الظروف الصحيحة للسماح والحفاظ خارج الخلية ملزمة يمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من التجربة والخطأ.
Photoaffinity وضع العلامات تلتف هذه القضايا من خلال السماح للالتساهمية ملزم من جزيء صغير وهدفه في سياق الأصلي للخلية. بدلا من شل حركة جزيء صغير لراتنج ضخمة كبيرة، وبدلا من ذلك تعديل جزيء كيميائيا لتثبيت اثنين ز صغير عمليroups: شاردة photoactivatable الذي يسمح التساهمية يشابك للبروتين الهدف عندما المشع مع طول موجة معينة من الضوء، ومجموعة المراسل أن يسمح للبروتين الهدف ليتم الكشف عن وعزل في وقت لاحق. يتم التعامل مع الخلايا الحية مع لجنة التحقيق photoaffinity، وتحقيق الربط وتساهمي crosslinks للبروتين الهدف، ومجمع التحقيق البروتين ومن ثم معزولة سليمة. وتتجلى خصوصية التحقيق ملزم إلى الهدف عن طريق إجراء تجربة المنافسة في موازاة ذلك، حيث يتم استخدام الزيادة في المركب الأصلي للتنافس بعيدا ملزمة لجنة التحقيق للبروتين الهدف.
تصميم وتركيب المجسات photoaffinity يختلف كثيرا عن جزيء صغير واحد إلى آخر، وسوف لا تكون مشمولة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، فقد تم نشر عدة مناقشات ممتازة على هذا الموضوع 5-9. والاعتبار الرئيسي هو أن لجنة التحقيق يحتفظ النشاط الحيوي للمركب الأصلي، وبالتالي presumabلاي ملزمة لنفس الهدف (ق). يجب أن يؤديها العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) دراسات لتحديد أي أجزاء من جزيء يمكن تعديلها دون فقدان النشاط الحيوي. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من مجموعات كيميائية مختلفة كما crosslinkers photoactivatable، بما في ذلك diazirine، بينزفينون، وأزيد أريل، ولكل منهما مزاياه وعيوبه 10. وبالمثل، هناك علامات مراسل المتعددة التي استخدمت لعزل البروتينات ملزم التحقيق. قد تكون الجماعات مراسل وظيفية من تلقاء نفسها، مثل البيوتين التي يشيع استخدامها أو العلامات الفلورية، أو قد تكون السلائف التي تتطلب مزيدا من functionalization لاحق إلى الخطوة photocrosslinking، التي لديها ميزة كونها أصغر حجما وبالتالي أقل احتمالا لتقديم تنازلات النشاط الحيوي 11.
في هذا البروتوكول، ونحن قد استخدمت التحقيق photoaffinity تحتوي على مجموعة diazirine photocrosslinking، وآلكاين محطة للمرفق مجموعة مراسل من خلال النحاس (I) -catalyzإد أزيد-آلكاين شاربلس-Hüisgen cycloaddition (أو انقر) رد فعل 12-15. الدراسات ريال، تسبر تصميم وتركيب، وقد تم نشر نتائج هذه الدراسات في أماكن أخرى 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
أساليب مختلفة لتحديد الأهداف من جزيئات صغيرة يمكن تصنيفها إلى فئتين: من أعلى إلى أسفل، حيث يتم استخدام النمط الظاهري الخلوية من المخدرات لتضييق أهدافها المحتملة بناء على وظائفها المعروفة، أو من أسفل إلى أعلى، حيث الهدف يتم التعرف مباشرة بوسائل كيميائية أو وراثية <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
