Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Bioaktive kleine Moleküle funktionieren grundlegend durch die Interaktion mit und die Änderung der Funktion von einer oder mehreren "Ziel" Moleküle, am häufigsten Proteine ​​in der Zelle. Bei der Wirkstofffindung, wenn eine aktive Verbindung durch phänotypische Screening entdeckt wird, die Identifizierung der molekularen Ziel (en) dieser Verbindung ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur für das Verständnis des Mechanismus der Wirkung und mögliche Nebenwirkungen der Verbindung, sondern auch für potenziell entdecken neue Biologie der Krankheitsmodell zugrunde liegen und den Weg für die Entwicklung neuer mechanistische Klassen von Therapeutika ¹ geebnet. Obwohl Zielidentifizierung nicht für ein Medikament erforderlich ist, um therapeutisch verwendet werden, in den letzten Jahren hat es eine zunehmende Anerkennung gewesen, dass neuartigen Arzneimittelkandidaten eher in klinischen Studien erfolgreich zu sein, und damit eine bessere Rendite erzielen, wenn ein validiertes Ziel bekannt ist ^2. Somit besteht für die Identifizierung kleiner ein wachsendes Interesse an Verfahren gewesenMolekül Zielproteine.

Eine klassische Zielidentifizierung Experiment beruht typischerweise auf Affinitätsreinigung, wobei das kleine Molekül von Interesse auf einem Harz immobilisiert ist und mit ganzen Zelllysaten inkubiert, wonach ungebundene Proteine ​​weggewaschen werden , und die verbleibenden Proteine ​​werden eluiert und ³ identifiziert. Während diese Technik die Ziele vieler kleiner Moleküle ⁴ ist es ungeeignet als universelles Ziel – ID – Verfahren aus mehreren Gründen zu identifizieren , verwendet wurde. Erstens muss das Zielprotein seine native Konformation nach der Zelllyse um behalten ihre Fähigkeit, in das kleine Molekül zu binden, beibehalten. Dies kann für Membranproteine ​​besonders problematisch sein, die oft Konformationsänderungen durchlaufen, nachdem sie von ihrer natürlichen Umgebung entfernt werden, oder einfach zu aggregieren und ausfallen Lösung. Zweitens muss das kleine Molekül chemisch so modifiziert werden, dass sie auf das Harz immobilisiert werden kann unter Beibehaltungseine Fähigkeit, das Zielprotein zu binden. Tiefbindungstaschen kann daher an ein kleines Molekül nicht mehr zugegriffen werden, wenn es zu dem Harz fixiert ist. Drittens muss die Bindungsaffinität ausreichend hoch sein, dass die Wechselwirkung während der Waschschritte aufrecht erhalten wird, die Identifizierung von geringerer Affinität Herstellung Wechselwirkungen schwierig. Viertens Umgebungsbedingungen wie pH, Ionenkonzentration oder der Anwesenheit anderer endogener Moleküle können räumlich innerhalb der Zelle variieren und sind manchmal Voraussetzungen für arzneimittel Target-Wechselwirkungen. Somit finden die richtigen Bedingungen außerhalb der Zelle zu ermöglichen und aufrechtzuerhalten Bindung kann eine erhebliche Menge von Versuch und Irrtum erforderlich.

Photoaffinitätsmarkierung umgeht diese Probleme durch die kovalente wodurch eines kleinen Moleküls und dessen Ziel innerhalb der nativen Kontext einer Zelle binden. Anstatt das kleine Molekül zu einem großen sperrigen Harz Immobilisierung wird das Molekül anstelle chemisch modifiziert zwei kleine funktionelle g installierenroups: eine photoaktivierbare Gruppe, die eine kovalente Vernetzung an das Zielprotein erlaubt, wenn es mit einer bestimmten Wellenlänge von Licht bestrahlt wird, und einer Reportergruppe, die das Zielprotein ermöglicht werden erkannt und anschließend isoliert. Lebende Zellen werden mit dem Photoaffinitäts-Sonde behandelt, wobei die Sonde bindet und kovalent vernetzt an das Zielprotein und die Sonde-Protein-Komplex wird dann isoliert intakt. Die Spezifität der Sonde an die Zielbindungs ​​wird durch Durchführen einer Konkurrenzexperiment parallel gezeigt, wo ein Überschuß der Ausgangsverbindung verwendet wird, entfernt zu konkurrieren der Sonde an das Zielprotein binden.

Das Design und die Synthese von Photoaffinitätssonden variiert stark von einem kleinen Molekül zu einem anderen, und wird nicht in diesem Protokoll abgedeckt werden; jedoch einige sehr gute Gespräche zu diesem Thema wurden ^5-9 veröffentlicht. Die Hauptüberlegung ist, dass die Sonde die Bioaktivität der Stammverbindung behält daher presumably Bindung an das gleiche Ziel (s). Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) -Studien durchgeführt werden müssen, um zu bestimmen, welche Teile des Moleküls ohne Verlust der Bioaktivität kann geändert werden. Eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Gruppen wurden als photoaktivierbare Vernetzer, einschließlich Diazirin, Benzophenon und Arylazid, die jeweils Vor- und Nachteile ¹⁰ verwendet. Ebenso gibt es mehrere Reporter-Tags, die verwendet wurden Sonde-bindende Proteine ​​zu isolieren. Reporter – Gruppen können allein, wie beispielsweise die üblicherweise verwendeten Biotin oder Fluoreszenzmarker funktionsfähig sein, oder sie können Vorstufen sein , die weitere Funktionalisierung an der photochemischen Vernetzungsschritt im Anschluss erfordern, die den Vorteil haben , kleiner ist und daher weniger wahrscheinlich ¹¹ – Bioaktivität zu kompromittieren.

In diesem Protokoll haben wir eine Photoaffinitäts-Sonde, enthaltend ein Diazirin photochemischen Vernetzungsgruppe und eine endständige Alkin für die Befestigung einer Reportergruppe über eine Cu (I) verwendet -catalyzed Azid-Alkin Sharpless-Huisgen – Cycloaddition (oder klicken) Reaktion ^12-15. Die SAR – Studien, die Sonde Design und die Synthese und die Ergebnisse dieser Untersuchungen an anderer Stelle ^16-18 veröffentlicht wurden.