זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
מולקולות קטנות ביו ביסודו לעבוד על ידי אינטראקציה עם ושינוי הפונקציה של אחד או יותר מולקולות "יעד", רוב החלבונים בדרך כלל, בתא. גילוי סמים, כאשר תרכובת פעילה מתגלה באמצעות הקרנת פנוטיפי, הזהות של הנפגע המולקולרי (ים) של המתחם כי הוא חיוני, לא רק להבנת מנגנון פעולה ואת תופעות לוואי אפשריות של המתחם, אלא גם עבור פוטנציאל גילוי ביולוגיה חדשה שבבסיס מודל המחלה ולסלול את הדרך לפיתוח של כיתות מכניסטית חדשות של הרפוי 1. למרות זיהוי המטרה אינו נדרש עבור תרופת לשמש טיפולית, בשנים האחרונות חלה הכרה גוברת כי מועמדי תרופה חדשניים סיכויים טובים יותר להצליח בניסויים קליניים, ולכן להניב תשואות טובות יותר על השקעה, אם יעד תוקף הוא ידוע 2. לפיכך, חלה התעניינות גוברת שיטות לזיהוי קטןחלבוני יעד מולקולה.
ניסוי זיהוי מטרות קלסי בדרך כלל מסתמך על טיהור זיקה, שבו המולקולה הקטנה של העניין היא משותקת על שרף וטופחה עם lysates התא כולו, שלאחריו חלבונים מאוגדים נשטפים והחלבונים הנותרים הם eluted וזיהו 3. בעוד טכניקה זו נעשה שימוש כדי לזהות את המטרות של מולקולות קטנות רבות 4, הוא אינו מתאים כשיטה מזהה היעד אוניברסלי מכמה סיבות. ראשית, חלבון המטרה חייב לשמור קונפורמציה המקורית שלו על תמוגה תא על מנת לשמר את יכולתה להיקשר המולקולה הקטנה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד עבור חלבונים בממברנה, אשר לעתים קרובות לעבור שינויים מרחביים לאחר הוצאתו מסביבת מולדתם, או פשוט המצרפי משקע מתוך פתרון. שנית, המולקולה הקטנה חייבת להיות שינוי כימי בצורה כזו כי זה יכול להיות משותק על השרף תוך שמירהיכולתה לקשור את חלבון המטרה. כיסים מחייבים עמוקים עשויים אפוא להיות נגישים מולקולה קטנה ברגע שהוא מקובע השרף. שלישית, זיקת המחייב חייבת להיות גבוהה מספיק שהאינטראקציה נשמרת במהלך שלבי הכביסה, מה שהופך זיהוי של אינטראקציות זיקה נמוכות מאתגרות. תנאים רביעיים, סביבתיים כגון pH, ריכוז יון, או הנוכחות של מולקולות אנדוגני אחרות יכולים להשתנות מרחבית בתוך התא הם לפעמים תנאים מוקדמים תרופתי-יעד. לכן, מציאת התנאים הנכונים כדי לאפשר ולשמור המחייב החיצוני של התא יכול דורש כמות משמעותית של ניסוי וטעייה.
תיוג Photoaffinity עוקף בעיות אלה בכך שהוא מאפשר הקשר הקוולנטי של מולקולה קטנה היעד שלה בהקשר יליד תא. במקום לשתק המולקולה הקטנה כדי שרף מגושם גדול המולקולה במקום שינוי כימי להתקין שני גרם פונקציונלי קטןroups: א מחצית photoactivatable המאפשר crosslinking קוולנטיים חלבון המטרה כאשר מוקרנים עם אורך גל מסוים של אור, וקבוצת כתב המאפשרת חלבון המטרה כדי להתגלות ובהמשך מבודד. תאי חי מטופלים עם חללית photoaffinity, החללית נקשרה ו Crosslinks קוולנטית חלבון המטרה, והמתחם-החלבון החללי הוא אז מבודד ללא פגע. הספציפי של חללית מחייבת את היעד מודגם על ידי ביצוע ניסוי תחרות במקביל, שבו עודף של תרכובת האב משמש להתחרות במרחק מחייב של חללית חלבון המטרה.
העיצוב וסינתזה של בדיקות photoaffinity משתנה מאוד בין מולקולה קטנה אחת לאחרת, ולא יהיה מכוסה בפרוטוקול זה; עם זאת, מספר דיונים מעולים בנושא פורסמו 5-9. השיקול העיקרי הוא כי החללית שומרת לעצמה את הפעילות הביולוגית של תרכובת האב, ולכן presumably מחייב לאותו היעד (ים). מבנה-פעילות יחסים (SAR) מחקרים חייבים להתבצע כדי לקבוע אילו חלקים של המולקולה ניתן לשנות ללא הפסד של פעילות ביולוגית. מגוון של קבוצות כימיות שונות שמש crosslinkers photoactivatable, כולל diazirine, benzophenone, ו תזיד aryl, אשר לכל אחד מאתנו יש יתרונות וחסרונות 10. כמו כן, ישנם תגי הכתב מרובים שנוצלו לבודד חלבונים קושרי החללית. קבוצות Reporter עשויות להיות פונקציונליות בכוחות עצמם, כגון ביוטין נפוץ או תגי פלורסנט, או עשוי להיות מבשרים הדורשים functionalization נוסף לאחר צעד photocrosslinking, אשר יש את היתרון של להיות קטן יותר ולכן פחות סביר להתפשר פעילות ביולוגית 11.
בפרוטוקול זה, השתמשנו בדיקת photoaffinity המכילה קבוצת diazirine photocrosslinking, וכן אלקין מסוף הקובץ המצורף של קבוצת כתב באמצעות Cu (I) -catalyzed אזיד-אלקין cycloaddition שארפלס-Hüisgen (או לחץ) התגובה 12-15. מחקרי SAR, לחקור תכנון וסינתזה, ותוצאות המחקרים הללו פורסמו במקומות אחרים 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישות שונות לזיהוי המטרות של מולקולות קטנות ניתן לקבץ באופן כללי לשתי קטגוריות: מלמעלה למטה, שם פנוטיפ הסלולר של התרופה משמש כדי לצמצם את המטרות הפוטנציאליות שלה המבוסס על הפונקציות הידועות שלהם, או מלמטה למעלה, כאשר היעד מזוהה ישירות באמצעים כימיים או גנטיים 3.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
- Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
- Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).
- Titov, D. V., Liu, J. O. Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules. Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).
- Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).
- Sumranjit, J., Chung, S. J. Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes. Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).
- Robles, O., Romo, D. Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies. Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).
- Zhou, Q., Gui, J., et al. Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds. J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).
- Li, Z., Hao, P., et al. Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling. Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).
- Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion. ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).
- Mackinnon, A. L., Taunton, J. Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).
- Smith, E., Collins, I. Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification. Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).
- Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. 1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen. Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).
- Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Head, S. A., Shi, W., et al. Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells. P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).
- Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling. J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).
- Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole. ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
