Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling
Summary
We describe here a method for identification of small molecule-binding proteins using photoaffinity labeling. The advantage of this technique is that binding and covalent labeling of the target proteins occurs within the live cellular environment, removing the risk of disrupting native protein structure and binding conditions upon cell lysis.
Abstract
Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several target identification methods have been developed and used to successfully elucidate the binding proteins of a variety of small molecules, these techniques have drawbacks that make them unsuitable for detecting certain types of small molecule-target interactions. In particular, non-covalent interactions that depend on native cellular conditions, such as those of membrane proteins whose structures may be perturbed upon cell lysis, are often not amenable to affinity-based target identification methods. Here, we demonstrate a method wherein a probe containing a photolabile group is used to covalently crosslink to the small molecule binding protein within the environment of the live cell, allowing the detection and isolation of the target protein without the need for maintenance of the interaction after cell lysis. This technique is a valuable tool for studying biologically interesting small molecules with unknown mechanisms, both in the context of basic biology as well as drug discovery.
Introduction
pequenas moléculas bioactivas fundamentalmente trabalhar por interagir com e alterar a função de uma ou mais moléculas de "alvo", mais comumente proteínas, na célula. Na descoberta de medicamentos, quando um composto activo é descoberto por meio de triagem fenotípica, a identificação do alvo molecular (s) de que o composto é crucial não apenas para a compreensão do mecanismo de acção e os potenciais efeitos colaterais do composto, mas também para potencialmente descobrir nova biologia subjacente ao modelo de doença e preparando o caminho para o desenvolvimento de novas classes mecanicistas de terapêutica 1. Embora a identificação do alvo não é necessária para um medicamento para ser usado terapeuticamente, nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento de que os novos candidatos a fármacos são mais propensos a ter sucesso em ensaios clínicos, e, portanto, produzir melhores retornos sobre o investimento, se um alvo validado é conhecida 2. Assim, tem havido um crescente interesse em métodos para a identificação de pequenasproteínas alvo molécula.
Um experimento identificação do alvo clássica tipicamente depende de purificação por afinidade, em que a pequena molécula de interesse é imobilizada sobre uma resina e incubada com lisados de células inteiras, após o que as proteínas não ligadas são lavadas e as proteínas restantes são eluídas e identificados 3. Embora esta técnica tenha sido utilizada para identificar os alvos de muitas moléculas pequenas 4, não é adequado como um método de identificação de destino universal para várias razões. Em primeiro lugar, a proteína alvo deve manter a sua conformação nativa após a lise celular, a fim de manter a sua capacidade de se ligar à molécula pequena. Isto pode ser particularmente problemático para proteínas de membrana, o que muitas vezes sofrem alterações conformacionais depois de ser removido do seu ambiente nativo, ou simplesmente agregado e precipitar para fora da solução. Em segundo lugar, a pequena molécula deve ser quimicamente modificado de tal forma que ele pode ser imobilizada na resina enquanto se mantéma sua capacidade de se ligar a proteína alvo. bolsas de ligação profundas podem, por conseguinte, tornam-se inacessíveis a uma molécula pequena, uma vez que é fixado à resina. Em terceiro lugar, a afinidade de ligação deve ser suficientemente elevada para que a interacção é mantido durante os passos de lavagem, tornando a identificação de interacções de afinidade inferiores desafiantes. Em quarto lugar, as condições ambientais tais como pH, concentração iónica ou a presença de outras moléculas endógenas pode variar espacialmente dentro da célula e são, por vezes, os pré-requisitos para a interacções fármaco-alvo. Assim, encontrar as condições correctas para permitir e manter do lado de fora da célula de ligação pode necessitar de uma quantidade significativa de tentativa e erro.
a marcação por fotoafinidade evita estes problemas, permitindo a ligação de uma pequena molécula e o seu alvo no contexto nativo de uma célula covalente. Em vez de imobilizar a molécula pequena a uma grande resina volumosa, em vez da molécula é quimicamente modificados para instalar duas pequenas g funcionalrupos: uma porção fotoactivável que permite a reticulação covalente à proteína alvo quando irradiado com um comprimento de onda particular de luz, e um grupo repórter que permite que a proteína alvo a ser detectada e subsequentemente isolado. As células vivas são tratados com a sonda de fotoafinidade, a sonda liga-se e reticula covalentemente à proteína alvo, e o complexo sonda-proteína é em seguida isolada intacta. A especificidade de ligação ao alvo da sonda é demonstrada através da realização de uma experiência de competição em paralelo, em que um excesso do composto de origem é usada para competir distância de ligação da sonda para a proteína alvo.
O design e síntese de sondas de fotoafinidade varia muito de uma pequena molécula para outra, e não será coberto neste protocolo; no entanto, vários excelentes discussões sobre o assunto foram publicados 5-9. A consideração principal é que a sonda retém a bioactividade do composto-mãe, por conseguinte presumabLY de ligação para o mesmo alvo (s). relação estrutura-actividade (SAR) estudos devem ser realizados para determinar que partes da molécula podem ser modificados sem perda de bioactividade. Uma variedade de diferentes grupos químicos têm sido utilizados como agentes de ligação cruzada foto-activáveis, incluindo diazirina, benzofenona, e azida de arilo, que cada um tem vantagens e desvantagens 10. Da mesma forma, existem várias marcações repórter que foram utilizadas para isolar proteínas de ligação à sonda. Os grupos repórter podem ser funcionais por si sós, tais como a biotina utilizada ou etiquetas fluorescentes, ou podem ser precursores que requerem maior funcionalização subsequente ao passo de foto-reticulação, que tem a vantagem de ser mais pequeno e, assim, menos susceptíveis de comprometer bioactividade 11.
Neste protocolo, utilizou-se uma sonda de fotoafinidade contendo um grupo diazirina fotorreticulação, e um alcino terminal para a ligação de um grupo descritor através de um Cu (I) -catalyzed Azide-Alcino Sharpless-Huisgen cicloadição (ou clique) reacção de 12-15. Os estudos de SAR, sondar concepção e síntese, e os resultados destes estudos foram publicados em outros lugares 16-18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes abordagens para identificar os alvos de pequenas moléculas podem ser agrupadas em duas categorias: de cima para baixo, onde o fenótipo celular da droga é usada para diminuir seus alvos potenciais com base em suas funções conhecidas, ou bottom-up, onde o alvo é identificada directamente por meios químicos ou genéticos 3. De cima para baixo ou estudos fenotípicos podem identificar certos processos celulares afectados pela droga (por exemplo, a transcrição / tradução / síntese d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Ben Nacev for advice on design of the photoaffinity labeling protocol, Dr. Wei Shi for synthesizing the itraconazole photoaffinity probe, Dr. Yongjun Dang for advice on affinity pull-down experiments, and other members of the J.O.L. laboratory for helpful comments and support. This work was supported in part by a PhRMA Foundation Fellowship in Pharmacology/Toxicology (to S.A.H.); National Cancer Institute Grant R01CA184103; the Flight Attendant Medical Research Institute; Prostate Cancer Foundation (J.O.L.); and the Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, which is funded in part by Grant UL1 TR 001079 from the National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).
Materials
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Life Technologies | 20490 | Make fresh day of use. Prepare 100 mM stock in water with 4 eq NaOH. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl] amine (TBTA) | AnaSpec | 63360-50 | Prepare 1.7 mM stock in a 4:1 ratio of t-butanol to DMSO, store at -20°C. |
| Copper Sulfate (CuSO4-5H2O) | LabChem, Inc. | LC13440-1 | Prepare 50 mM stock in water, store at room temperature. |
| Biotin-azide | Click Chemistry Tools | AZ104-100 | Prepare 10 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| Alexa Fluor 647-azide | Life Technologies | A10277 | Prepare 1 mM stock in DMSO, store at -20°C. |
| 365 nm UV lamp | Spectroline | FC100 | UV-blocking glasses should be worn while operating. |
| Protease inhibitor tablets, EDTA-free | Roche Life Science | 11873580001 | Prepare 50x solution in water and store at -20°C. |
| Sonicator | Branson | Sonifier 250 | Set to output 1, duty 30%. |
| Fluorescent gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | FLA 9500 | Use red laser to detect Alexa-fluor 647. |
| Detergent-compatible Dc protein assay kit | Bio-Rad | 5000112 | |
| High Capacity Streptavidin Agarose beads | Life Technologies | 20359 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium, low glucose | ThermoFisher Scientific | 11885092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin/Streptamycin solution | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| SDS Sample Buffer (2X) | ThermoFisher Scientific | LC2676 |
References
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