Эффективное нуклеиновые кислоты Добыча и 16S рРНК генов Секвенирование для Бактериальные сообщества Характеристика
Summary
Описывается эффективный, надежный и экономически эффективный способ извлечения нуклеиновой кислоты из мазков для определения характеристик бактериальных сообществ с использованием 16S рРНК гена ампликона секвенирования. Метод позволяет общий подход обработки для нескольких типов проб и вмещает несколько ниже по течению аналитических процессов.
Abstract
Существует растущая оценка роли микробных сообществ как критические модуляторов для здоровья человека и болезней. технологии секвенирования высокой пропускной способности позволили для быстрого и эффективного определения характеристик бактериальных сообществ с использованием 16S рРНК секвенирование гена из различных источников. Несмотря на то, легко доступные инструменты для анализа последовательностей 16S рРНК имеют стандартных вычислительных рабочих процессов, обработки образцов для экстракции ДНК остается постоянной источник изменчивости в различных исследованиях. Здесь мы опишем эффективный, надежный и экономически эффективный способ извлечения нуклеиновой кислоты из мазков. Мы также разграничить вниз по течению методы 16S рРНК секвенирования генов, в том числе генерации библиотек секвенирования, контроль качества данных и анализа последовательности. Рабочий процесс может работать с несколькими типами образцов, в том числе стула и смывов, собранных из различных анатомических мест и видов хозяев. Кроме того, выделяют ДНК и РНК могут быть разделены и использованыдля других приложений, в том числе весь секвенирование генома или Секвенирование РНК. Описанный метод позволяет общий подход обработки для нескольких типов образцов и вмещает вниз по течению анализ геномной, метагеномной и транскрипционный информации.
Introduction
Человек ниже репродуктивного тракта, желудочно – кишечного тракта, дыхательных путей, кожи и заселены сложных бактериальных сообществ , которые имеют решающее значение для поддержания гомеостаза тканей и поддержания здоровья хозяина 1. Например, некоторые лактобактерии создают неблагоприятную среду для патогенных микроорганизмов путем подкисления свода влагалища, производя антимикробных эффекторы и модуляции локального иммунитета хозяина 2-4. Растущее признание важности для бактериальной микробиомом имеет также повышенный интерес к характеризующая бактериальных сообществ во многих клинических ситуациях. Здесь мы опишем метод определения состава бактериальной микробиомом из генитальных мазках. Протокол может быть легко модифицирован для образцов стула и смывов, собранных из других анатомических местах и других видов хозяев.
Из-за ограничений, присущих в количестве образцов, которые могут быть собраны и хранятся от данного шпилькеучастник Y, этот протокол был разработан для извлечения ДНК, РНК , а возможно даже белок из одного тампона с использованием адаптированной фенол-хлороформ на основе бусинка биений метода 5,6. Сочетание физического разрушения бактериальных клеточных стенок с бисерной избиению и химического разрушения с моющими средствами позволяет быстро лизиса грамположительных, грамотрицательных и кислотоустойчивые бактерии без дополнительных ферментативных стадий пищеварения. Для получения высокого качества РНК, рекомендуется использовать сухие тампоны, которые хранились при температуре не ниже 4 ° С сразу после сбора и во время транспортировки в лабораторию (если это применимо), и хранится долгосрочной перспективе, при -80 ° С.
Для определения бактериальной микробиомом в данном образце, эта процедура использует 16S рРНК гена ампликона секвенирования, который в настоящее время является наиболее экономически эффективным средством для комплексного назначить бактериальной таксономии и выполняют относительную количественную оценку. Альтернативные методы включают целевые кПЦР 7, пользовательские microarrAYS 8, и все-секвенирование генома 9. Ген 16S рРНК содержит девять гипервариабельные области, и нет единого мнения относительно оптимального область V, чтобы последовательность для вагинальных исследований микробиомом. При этом мы используем набор праймеров 515F / 806R и построить на трубопроводе , разработанный Caporaso и др. 10-12. Caporaso и др. 'S набор праймеров 515F / 806R позволяет мультиплексирование сотен образцов на один прогон секвенирования из – за наличия тысяч проверенных праймеров и со штрих совместимости с Illumina секвенирования платформ. В отличие от 27F / 338R праймера человеческого микробиомом проекта установлено 13, 515F / 806R также эффективно усиливает Bifidobacteriaceae и , таким образом , точно фиксирует Gardnerella влагалищной, является важным членом вагинального микробного сообщества у некоторых женщин. В качестве альтернативы, пара 338F / 806R праймер был успешно использован для Пиросеквенирование вагинальных образцов 14 и пара 515F / 926R праймер имеет Recently становятся доступными для следующего поколения секвенирования 12.
И, наконец, этот протокол содержит основные инструкции по выполнению анализа 16S ампликона с использованием количественного Исследования в микробной экологии (QIIME) пакета программного обеспечения 15. Успешная реализация команд QIIME, описанных здесь, дает таблицу, содержащую бактериальные таксономические содержаний для каждого образца. Множество дополнительных мер контроля качества, таксономические методы классификации и этапы анализа могут быть включены в анализ, как это подробно описано на веб-сайте QIIME (http://qiime.org/index.html). Если анализ будет выполняться на компьютере Apple, пакет MacQIIME 16 обеспечивает легкую установку QIIME и его зависимостей. Альтернативные пакеты программного обеспечения для анализа последовательностей генов 16S рРНК включают Mothur 17 и UPARSE 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол для идентификации и характеристики относительных бактериальных содержаний в вагинальной тампоном человека. Этот протокол может быть легко адаптирована для других типов образцов, таких как кале и смывах других участков тела, а также для образцов, собранных из широкого спектра источников. Экстракция нуклеиновой кислоты по бусинок биения в буферном растворе фенола и хлороформа позволяет для выделения ДНК и РНК, что особенно важно при работе с драгоценными образцов, собранных с помощью клинических исследований. Выделенную ДНК микобактерий отлично подходит для бактериальной таксономической идентификации и геномной сборки, в то время как одновременный сбор РНК дает возможность определить функциональное бактериальная, хост и вирусные вклады через Секвенирование РНК. Описанный протокол использует проверенную набор праймеров , один шаг , который был успешно развернут на широком диапазоне типов образцов, включая человека, собак, а также отбор проб окружающей среды 10 </suр>. Наличие тысяч праймеров позволяет со штрих мультиплексирование образцов и значительной экономии на затратах секвенирования. Полная стоимость (включая все реагенты, один прогон последовательности, а также праймеры, но не оборудования) составляет около $ 20 за образец при 200 образцов мультиплексируются. Кроме того, существует очень высокая степень воспроизводимости при наличии нескольких мазки из того же сайта образец обрабатываются независимо друг от друга через весь трубопровод. В целом, протокол экономически эффективным, гибким, надежным и повторяемым.
Часть экстракции нуклеиновой кислоты данного протокола ограничивается мерами предосторожности, необходимые при работе с фенолом и хлороформом, а также проблем автоматизации трубопровода к высокой пропускной способностью, 96-луночного формата пластины. Кроме того, активная шарик Избиение используется для механического лизиса ножницы бактериальной ДНК приблизительно 6 фрагментов килобаза; если более длинные фрагменты ДНК необходимы для последующих применений, длительность шарика размола сhould быть сокращен. Ограничения бактериальной идентификации части этого протокола присущи любому методу, который опирается на 16S рРНК секвенирование гена. 16S рРНК секвенирование идеально подходит для идентификации бактерий к роду и даже видового уровня, но редко обеспечивает идентификацию уровня напряжения. В то время как вариабельной области В4 гена 16S рРНК обеспечивает надежную дискриминацию среди большинства видов бактерий 11, дополнительные вычислительные методы , такие как Oligotyping 31 , возможно , потребуется использовать для точного выявления определенных видов, таких как Lactobacillus crispatus. И, наконец, информация о точных бактериальных функциональных возможностей в конкретном образце не может быть определено с помощью 16S рРНК секвенирование гена в одиночку, хотя этот протокол позволяет извлекать всю геномную ДНК и РНК, которые могут быть использованы для достижения этой цели.
Самым важным шагом к обеспечению успеха с этим протоколом принимает большую осторожность, чтобы не допустить загрязнения дурьING сбор образцов, экстракции нуклеиновых кислот и ПЦР-амплификации. Обеспечение стерильности во время сбора образцов путем носить чистые перчатки и используя стерильные тампоны, трубки и ножницы. Для оценки на предмет загрязнения материалов сбора, сбора негативных тампоны контроля путем размещения дополнительных неиспользуемых тампоны непосредственно в транспортных труб во время отбора проб. В лаборатории, выполнять все этапы предварительной амплификации в стерилизованную колпаком, содержащие только обезвредить материалы и используя только молекулярный класс, ДНК свободных реагентов. Во время экстракции нуклеиновых кислот, предотвращения перекрестного загрязнения с использованием новых стерильного пинцета и свежие перчатки с каждого образца, и держать все пробирки не закрыты, если используется. Обработка неиспользуемых мазки параллельно обеспечивает стерильность как сбор образцов и выделения нуклеиновых кислот; неиспользованные тампоны не дают осадок после осаждения изопропанолом и промывания этанолом. Если осадок появляется, выполняют амплификации гена 16S рРНК, чтобы определить возможный источникзагрязнение (например, наличие стрептококков или стафилококков указывало бы загрязнение кожи). Кроме того, выполняют ПЦР амплификации без каких-либо реакций контрольных шаблонов параллельно, чтобы гарантировать, что реагенты и ПЦР-реакции не были загрязнены. Если полоса появляется в элементе управления нет шаблона, удалите реагенты и повторить амплификации со свежими реагентами. Принимая эти меры предосторожности обеспечит успешное секвенирование бактерий, представляющих интерес.
Стадии амплификации ПЦР, как правило, требуют наибольшего устранения неполадок. Усиливая в наборах из двенадцати образцов обеспечивает баланс между эффективностью и последовательностью. Полное отсутствие полос во всех образцах в заданном наборе амплификации указывает на систематический отказ, например, забывая добавить реагент или неправильно программирования Термоциклер. Отсутствие полосы из нескольких образцов, как правило, из-за человеческой ошибки, и усилений должен быть повторно гип с тем же спаривание образца и обратного праймера. В случае продолжающегося отсутствия полосы, образец может быть повторно амплифицировали с использованием обратного праймера с другим штрих-кодом. Повторные неудачи амплификации с множественными обратных праймеров может указывать ингибитор, присутствующий в образце. В этом случае очистка ДНК с колонной часто приводит к удалению ингибиторов без существенного изменения относительных бактериальных содержаний. Если несколько полос в результате после амплификации, повторной амплификации образца с другим обратным праймером штрих-кода.
В дополнение к предотвращению загрязнения окружающей среды и обеспечения амплификации одного конкретного продукта, успешное секвенирование опирается на уход при подготовке бассейн библиотеки. Цель состоит в том, чтобы объединить эквимолярные количества ампликонов каждого образца, чтобы обеспечить примерно такое же количество последовательности считывает одну пробу. Если концентрации нуклеиновых кислот до амплификации сопоставимы, просто добавляя равные объемы каждого саампликонов mple является достаточным при создании пула библиотеки. Тем не менее, если концентрации нуклеиновых кислот весьма различны, и добавлены в равном объеме, образец с низкой концентрацией нуклеиновых кислот будут плохо представлены с низким числом чтения. В этом случае, можно добавить больший объем ампликонов из-за низкой концентрации образца, основанной на относительной интенсивности полосы геля. В качестве альтернативы, можно более тщательно удалить праймеров из отдельных ампликонов, количественно концентрации ампликона отдельного сэмпла с помощью флуорометрического набора дц квантификации, и точно совместить эквимолярные количества каждого образца.
После того, как хорошо сбалансированный ампликона бассейн генерируется, становится критическим, чтобы тщательно измерить концентрацию пула. После разбавления осторожным и шип-ин с PhiX увеличить сложность чтения имеет решающее значение для достижения оптимальных результатов секвенирования. Высокая пропускная способность секвенсоры, которые используют sequenчных путем синтеза очень чувствительны к плотности кластеров на проточную кювету. Загрузка библиотеки пула , который слишком концентрированный приведет к overclustering, с более низкими показателями качества, низким выходом данных и неточной демультиплексирования 32. Загрузка библиотеки пул, который слишком разведенным также приведет к низким выходом данных. Тщательно количественной оценки пул библиотеки перед секвенированием обеспечит оптимальные результаты.
16S рРНК секвенирование гена обеспечивает комплексную оценку бактерий, присутствующих в данном образце и является абсолютно важным первым шагом в выработке гипотезы. Наличие богатого набора метаданных дальнейшего позволяет исследователю испытать ассоциации между отдельными видами бактерий и важных биологических факторов. Кроме того, тот же самый 16S информация может быть использована для вывода бактериальных функции , используя такие инструменты, как PICRUSt 33. Конечная цель состоит в том, чтобы использовать 16S характеристику для идентификации новых ассоциаций, которые могут бытьдополнительно испытана и утверждена в модельных системах, добавляя к нашему растущему пониманию воздействия бактериального микробиомом на здоровье человека и болезни.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Элизабет Бирн, Дэвид Gootenberg и Кристина Gosmann для критической обратной связи по протоколу; Меган Балдридж, Скотт Хэндли, Синди Монако, и Джейсон Норман для образца руководства подготовки и демонстраций; Венди Garrett, Кертис Huttenhower, Скип Virgin, и Брюс Уокер за советом протоколов и плодотворных дискуссий; и Джессика Hoisington-Лопес для поддержки секвенирования. Эта работа была поддержана Фондом Билла и Мелинды Гейтс и NIAID (1R01AI111918). DSK получил дополнительную поддержку со стороны Wellcome Фонда Burroughs. MNA была поддержана наградой номером T32GM007753 от NIGMS, и Павла и Daisy Soros Fellowship. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIGMS или НИЗ.
Materials
| Equipment: | |||
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
| Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
| Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
| MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
| ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
| SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
| 2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
| UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
| 1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
| 0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
| Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
| UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
| 2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
| Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
| Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
| 1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
| PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
| 0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
| Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
| 50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
| DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
| 50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
| AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
| UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers: | |||
| 515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
| Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
| Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |
References
- Huttenhower, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486, 207-214 (2012).
- O’Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. A. Vaginal pH and microbicidal lactic acid when lactobacilli dominate the microbiota. PloS one. 8, e80074 (2013).
- Aldunate, M. Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).
- Anahtar, M. N., et al. Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract. Immunity. 42, 965-976 (2015).
- Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Srinivasan, S., et al. Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis. PloS one. 5, e10197 (2010).
- Dols, J. A., et al. Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis. American journal of obstetrics and gynecology. 204, 301-307 (2011).
- Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature methods. 9, 811-814 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4516-4522 (2011).
- Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PloS one. 7, e37818 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature. 10, 996-998 (2013).
- AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen Available from: https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/ (2015)
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf (2008)
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data. GigaScience. 2, 16 (2013).
- Eren, A. M., et al. Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation. PloS one. 6, e26732 (2011).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).
