Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione
Summary
Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.
Abstract
Vi è un crescente apprezzamento per il ruolo delle comunità microbiche, come modulatori critici della salute e della malattia. tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento hanno consentito per la caratterizzazione rapida ed efficiente delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene sequenziamento da una varietà di fonti. Anche se gli strumenti disponibili per 16S rRNA analisi di sequenza hanno flussi di lavoro di calcolo standardizzati, campione di trasformazione per l'estrazione del DNA rimane una costante fonte di variabilità tra gli studi. Qui si descrive un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi. Abbiamo anche delineare i metodi a valle per 16S rRNA gene sequenziamento, tra cui la generazione di librerie di sequenziamento, il controllo della qualità di dati e analisi di sequenza. Il flusso di lavoro in grado di ospitare diversi tipi di campioni, tra cui feci e tamponi raccolti da una varietà di luoghi anatomici e specie ospiti. Inoltre, recuperato DNA e RNA può essere separato e usatoper altre applicazioni, tra cui tutto il sequenziamento del genoma o RNA-Seq. Il metodo descritto consente un approccio di elaborazione comune per molteplici tipi di campioni e può ospitare analisi valle di informazioni genomiche, metagenomica e trascrizionale.
Introduction
Il tratto umano inferiore riproduttivo, sistema gastrointestinale, le vie respiratorie e la pelle sono colonizzate da comunità batteriche complesse che sono fondamentali per il mantenimento della omeostasi tissutale e sostenere la salute dell'ospite 1. Per esempio, alcuni lattobacilli creare un ambiente inospitale per gli agenti patogeni per acidificazione della volta vaginale, producendo effettori antimicrobici e modulando l'immunità host locale 2-4. Il crescente apprezzamento per l'importanza del microbiome batterica è aumentato anche l'interesse nel caratterizzare comunità batteriche in molti contesti clinici. Qui si descrive un metodo per determinare la composizione del microbioma batterica tamponi genitali. Il protocollo può essere facilmente modificato per campioni di feci e tamponi raccolti da altre sedi anatomiche e di altre specie ospiti.
A causa delle limitazioni inerenti il numero di campioni che possono essere raccolti e conservati da un dato pernoy partecipante, questo protocollo è stato progettato per estrarre il DNA, RNA, e potenzialmente anche proteine da un singolo tampone utilizzando un adeguato fenolo-cloroformio basato tallone-pestaggio metodo 5,6. La combinazione di interruzione fisica delle pareti delle cellule batteriche con bead-battitura e la rottura chimica con detergenti permette una rapida lisi dei batteri Gram-positivi, Gram-negativi, e l'acido-veloce senza ulteriori passaggi digestione enzimatica. Per ottenere l'RNA di alta qualità, si consiglia di utilizzare tamponi a secco che sono stati tenuti pari o inferiore a 4 ° C subito dopo la raccolta e durante il trasporto al laboratorio (se applicabile), e conservato a lungo termine a -80 ° C.
Per determinare la microbiome batterica all'interno di un dato campione, questa procedura utilizza rRNA 16S gene amplicone sequenziamento, che è attualmente il mezzo più conveniente per assegnare completo tassonomia batterica ed eseguire quantificazione relativa. Metodi alternativi comprendono mirati qPCR 7, microarr personalizzatoAYS 8, e tutto il sequenziamento del genoma 9. Il gene 16S rRNA contiene nove regioni ipervariabili, e non c'è consenso per quanto riguarda la regione ottimale V di sequenziare per gli studi microbiome vaginali. Qui usiamo il set di primer 515F / 806R e costruire sul gasdotto progettato da Caporaso et al. 10-12. Caporaso s 'et al. 515F / 806R Primer set permette il multiplexing di centinaia di campioni in una sola corsa di sequenziamento a causa della disponibilità di migliaia di codici a barre primer convalidati e la compatibilità con le piattaforme di sequenziamento Illumina. A differenza del progetto microbioma umano 27F / 338R Primer set 13, 515F / 806R anche amplifica efficacemente Bifidobacteriaceae e cattura così accuratamente Gardnerella vaginalis, un membro importante della comunità microbica vaginale in alcune donne. In alternativa, una coppia di primer 338F / 806R è stato utilizzato con successo per pyrosequencing di campioni vaginali 14 e una coppia di primer 515F / 926R ha recente resi disponibili per il sequenziamento di prossima generazione 12.
Infine, questo protocollo fornisce le istruzioni base per eseguire analisi 16S amplicone utilizzando Insights quantitativi nel Ecologia microbica (QIIME) pacchetto software 15. Il successo dell'attuazione dei comandi QIIME qui descritte si ottiene una tabella contenente abbondanze batteriche tassonomiche per ogni campione. Molte operazioni aggiuntive di controllo di qualità, i metodi di classificazione tassonomica, e fasi di analisi possono essere incorporati in analisi, come descritto in dettaglio sul sito QIIME (http://qiime.org/index.html). Se l'analisi viene eseguita su un computer Apple, il pacchetto MacQIIME 16 fornisce una facile installazione di QIIME e le sue dipendenze. Pacchetti software alternativi per 16S rRNA analisi della sequenza del gene sono Mothur 17 e 18 UPARSE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un protocollo per l'identificazione e la caratterizzazione delle abbondanze batteriche relativi all'interno di un tampone vaginale umana. Questo protocollo può essere facilmente adattato per altri tipi di campioni, come feci e tamponi di altri siti del corpo, e per campioni raccolti da un'ampia varietà di fonti. L'estrazione degli acidi nucleici da stallonatore battitura in una soluzione tamponata del fenolo e cloroformio consente l'isolamento sia del DNA e RNA, che particolarmente importante quando è lavora con campioni preziose raccolte tramite studi clinici. Il DNA batterico isolato è eccellente per batterica identificazione tassonomica e l'assemblaggio del genoma, mentre la raccolta simultanea di RNA offre l'opportunità di determinare batterica funzionale, host e contributi virali attraverso RNA-Seq. Il protocollo descritto utilizza un insieme convalidato uno stadio di primer che è stato implementato su una vasta gamma di campioni, compresi gli esseri umani, canino, e campioni ambientali 10 </sup>. La disponibilità di migliaia di codici a barre primer consente la multiplazione dei campioni e un notevole risparmio sui costi di sequenziamento. Il costo completo (compresi tutti i reagenti, una sola corsa di sequenziamento, e primer ma non attrezzature) è di circa $ 20 per esempio, quando 200 campioni sono multiplexati. Inoltre, vi è molto elevata riproducibilità quando più tamponi dallo stesso sito di esempio vengono elaborati in modo indipendente attraverso l'intera pipeline. Nel complesso, il protocollo è economicamente efficiente, flessibile, affidabile e ripetibile.
La porzione di estrazione degli acidi nucleici di questo protocollo è limitata dalle misure di sicurezza necessarie quando si lavora con fenolo e cloroformio, e le sfide della automatizzando la pipeline per un alto rendimento, formato a 96 pozzetti. Inoltre, il tallone battito vigoroso utilizzato per cesoie lisi meccanica del DNA batterico di circa 6 frammenti kilobase; se sono necessari frammenti di DNA più lunghi per le applicazioni a valle, la durata del tallone battito should essere abbreviato. Le limitazioni della porzione identificazione batterica di questo protocollo sono inerenti a qualsiasi metodo che si basa su 16S rRNA sequenziamento del gene. 16S rRNA sequencing è ideale per l'identificazione batterica al livello di genere e anche di specie, ma raramente fornisce l'identificazione livello di deformazione. Mentre la regione variabile V4 del gene 16S rRNA fornisce discriminazione robusto tra la maggior parte delle specie batteriche 11, possono avere bisogno di essere utilizzato per identificare con precisione alcune specie, come Lactobacillus crispatus metodi computazionali aggiuntivi come Oligotyping 31. Infine, le informazioni sulle capacità funzionali batteriche precise all'interno di un campione particolare, non può essere determinata 16S rRNA gene sequenziamento solo, anche se questo protocollo consente l'estrazione di DNA intero genoma e RNA che possono essere utilizzati verso questo scopo.
La fase più critica per garantire il successo con questo protocollo sta prendendo molta cura per evitare contaminazione During raccolta del campione, estrazione degli acidi nucleici, e l'amplificazione PCR. Assicurarsi che la sterilità al momento della raccolta dei campioni indossando guanti puliti ed utilizzando tamponi sterili tubi, e forbici. Per valutare la contaminazione dei materiali di raccolta, raccogliere tamponi di controllo negativo mettendo tamponi inutilizzati aggiuntivi direttamente in provette di trasporto al momento del campionamento. Nel laboratorio, eseguire tutte le fasi di pre-amplificazione in una cappa sterile contenente forniture solo decontaminati e utilizzando solo grado molecolare, reagenti privi di DNA. Durante l'estrazione degli acidi nucleici, evitare la contaminazione incrociata utilizzando nuove pinze sterili e guanti fresche con ogni campione, e mantenendo tutti i tubi chiusi se non in uso. Elaborazione di tamponi non utilizzati in parallelo garantisce la sterilità sia della raccolta dei campioni e l'estrazione degli acidi nucleici; i tamponi inutilizzati non devono produrre un pellet dopo isopropanolo precipitazioni e lavaggio etanolo. Se si visualizza un pellet, eseguire 16S rRNA amplificazione genica per determinare una possibile fonte dila contaminazione (ad esempio, la presenza di Streptococcus o Staphylococcus indicherebbe la contaminazione della pelle). Inoltre, eseguire amplificazioni PCR senza reazioni di controllo modello in parallelo per garantire che i reagenti PCR e reazioni non sono stati contaminati. Se una band appare in un controllo alcun modello, eliminare i reagenti e ripetere l'amplificazione con i reagenti freschi. Prendendo queste precauzioni assicurerà sequenziamento successo dei batteri di interesse.
La fase di amplificazione PCR tende a richiedere più la risoluzione dei problemi. Amplificando in gruppi di dodici campioni fornisce un equilibrio tra efficienza e la coerenza. La totale assenza di bande in tutti i campioni in un dato insieme di amplificazione indica un errore sistematico, ad esempio, dimenticando di aggiungere un reagente o programmare in modo errato il termociclatore. L'assenza di una banda da alcuni campioni di solito è causa di errore umano e le amplificazioni dovrebbe essere ri-rONU con lo stesso abbinamento di campione e primer reverse. Nel caso della assenza continua di una banda, il campione può essere nuovamente amplificato utilizzando un primer inverso con un codice a barre diverso. fallimenti ripetuti di amplificazione con più primer inverso possono indicare un inibitore presente nel campione. In tal caso, la pulizia del DNA con una colonna spesso rimuovere inibitori senza alterare significativamente abbondanze batteriche relativi. Se più bande risultato dopo l'amplificazione, ri-amplificare il campione con un diverso codice a barre primer reverse.
Oltre a prevenire la contaminazione ambientale e garantendo amplificazione di un singolo prodotto specifico, sequenziamento successo deduce attenzione durante la preparazione della piscina libreria. L'obiettivo è di combinare quantità equimolari di ampliconi di ciascun campione per accertarsi circa lo stesso numero di sequenza letture per campione. Se le concentrazioni di acido nucleico prima dell'amplificazione sono comparabili, aggiungendo semplicemente volumi uguali di ciascuna saampliconi di Mple sono sufficienti quando si crea il pool biblioteca. Tuttavia, se le concentrazioni di acido nucleico sono molto diversi e aggiunto in un volume uguale, il campione con la bassa concentrazione di acido nucleico sarà poco rappresentato con un basso numero di letture. In questo caso, è possibile aggiungere un volume maggiore di ampliconi dal campione bassa concentrazione basato sulla relativa intensità della banda gel. In alternativa, è possibile rimuovere più rigoroso primers dai singoli ampliconi, quantificare la concentrazione di ampliconi singolo campione utilizzando un kit dsDNA quantificazione fluorimetrico, e precisamente combinare quantità equimolari di ciascun campione.
Una volta che una piscina amplicone ben bilanciata è generato, diventa fondamentale per misurare accuratamente la concentrazione della piscina. La successiva accurata diluizione e spike-in con Phix per aumentare la complessità di lettura è fondamentale per ottenere risultati ottimali di sequenziamento. sequencer high-throughput che utilizzano Sequencing per sintesi sono molto sensibili alla densità del cluster sulla cella di flusso. Caricamento di un pool di libreria che è troppo concentrato si tradurrà in Overclustering, con punteggi più bassi di qualità, l'uscita dei dati più bassi, e imprecisa demultiplexing 32. Caricamento di un pool di libreria che viene troppo diluito sarà anche tradursi in uscita dati bassa. Attenzione quantificare la piscina libreria prima del sequenziamento garantirà risultati ottimali.
16S rRNA sequenziamento del gene fornisce una valutazione completa dei batteri presenti in un dato campione ed è un primo passo assolutamente cruciale nella generazione di ipotesi. La presenza di un ricco set di metadati ulteriormente permette al ricercatore di testare le associazioni tra particolari specie batteriche e di importanti fattori biologici. Inoltre, lo stesso 16S informazioni possono essere usate per dedurre le funzioni batteriche utilizzando strumenti come PICRUSt 33. L'obiettivo finale è quello di utilizzare 16S caratterizzazione per individuare nuove associazioni che possono essereulteriormente testato e convalidato in sistemi modello, aggiungendo alla nostra crescente comprensione dell'impatto del microbioma batterica sulla salute umana e le malattie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Elizabeth Byrne, David Gootenberg, e Christina Gosmann per un feedback critico sul protocollo; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco, e Jason Norman per l'orientamento preparazione del campione e manifestazioni; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgin, e Bruce Walker per la consulenza di protocollo e fruttuose discussioni; e Jessica Hoisington-Lopez per il supporto sequenziamento. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Bill e Melinda e il NIAID (1R01AI111918). DSK ha ricevuto un ulteriore sostegno da parte del Fondo Burroughs Wellcome. MNA è stato sostenuto dal numero di riconoscimento T32GM007753 dal NIGMS, e la Paul e Daisy Soros Fellowship. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIGMS o NIH.
Materials
| Equipment: | |||
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
| Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
| Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
| MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
| ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
| SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
| 2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
| UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
| 1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
| 0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
| Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
| UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
| 2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
| Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
| Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
| 1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
| PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
| 0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
| Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
| 50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
| DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
| 50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
| AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
| UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers: | |||
| 515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
| Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
| Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |
References
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