كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف
Summary
وصفنا وسيلة فعالة وقوية، وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من مسحات لتوصيف المجتمعات البكتيرية باستخدام 16S الريباسي amplicon الجينات التسلسل. يسمح طريقة لنهج المعالجة المشترك لأنواع عينة متعددة ويستوعب عددا من العمليات التحليلية المصب.
Abstract
هناك إدراك متزايد لدور المجتمعات الميكروبية كما جهري الصحية الحرجة الإنسان والمرض. سمحت تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية لتوصيف السريع والفعال للمجتمعات البكتيرية باستخدام 16S الريباسي التسلسل الجيني من مجموعة متنوعة من المصادر. على الرغم من الأدوات المتاحة بسهولة ل16S الريباسي تحليل تسلسل لها سير العمل الحسابية الموحدة، وتجهيز العينات لاستخراج الحمض النووي لا يزال يشكل مصدر استمرار التباين بين الدراسات. نحن هنا وصف وسيلة فعالة وقوية، وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من مسحات. نحن أيضا رسم طرق المصب لتسلسل الجينات 16S الريباسي، بما في ذلك الجيل من المكتبات التسلسل، ومراقبة جودة البيانات، وتحليل تسلسل. سير العمل يمكن أن تستوعب عدة أنواع العينات، بما في ذلك البراز ومسحات تم جمعها من مجموعة متنوعة من المواقع التشريحية والأنواع المضيفة. بالإضافة إلى ذلك، تعافى DNA و RNA يمكن فصلها واستخدامهالتطبيقات أخرى، بما في ذلك التسلسل الجينوم كله أو RNA وما يليها. الطريقة الموصوفة يسمح لنهج المعالجة المشترك لأنواع عينة متعددة ويستوعب تحليل المصب من المعلومات الجينومية، metagenomic والنسخي.
Introduction
واستعمرت السفلي الإنسان الجهاز التناسلي والجهاز الهضمي والجهاز التنفسي، والجلد من قبل المجتمعات البكتيرية المعقدة التي تعتبر بالغة الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة ودعم صحة المضيف 1. على سبيل المثال، بعض العصيات اللبنية خلق بيئة غير مضيافة لمسببات الأمراض التي تزيد من حامضية المهبل قبو، وإنتاج المؤثرات المضادة للميكروبات وتحوير المضيف المحلي الحصانة 2-4. زاد التقدير المتزايد لأهمية وmicrobiome البكتيرية أيضا مصلحة في وصف المجتمعات البكتيرية في العديد من السياقات السريرية. نحن هنا تصف طريقة لتحديد تكوين microbiome البكتيرية من مسحات التناسلية. بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لعينات البراز ومسحات جمعت من مواقع تشريحية أخرى والأنواع المضيفة الأخرى.
بسبب القيود المتأصلة في عدد العينات التي يمكن جمعها وتخزينها من عشيق معينذ مشارك، وقد تم تصميم هذا البروتوكول لاستخراج الحمض النووي، RNA، وربما حتى البروتين من مسحة واحدة باستخدام تكييفها الفينول كلوروفورم مقرها حبة الضرب طريقة 5،6. مزيج من التعطيل الفعلي لجدران الخلايا البكتيرية مع حبة الضرب وتعطيل الكيميائية مع المنظفات يسمح تحلل سريع من البكتيريا إيجابية الجرام، سالبة الجرام، وحمض السرعة دون خطوات عملية الهضم الأنزيمية إضافية. للحصول على الحمض النووي الريبي جودة عالية، فمن المستحسن استخدام مسحات الجافة التي تم الاحتفاظ بها عند أو أقل من 4 درجات مئوية بعد جمع فورا وخلال النقل إلى المختبر (إن وجدت)، وتخزينها على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
لتحديد microbiome البكتيرية في عينة معينة، هذا الإجراء يستخدم 16S الريباسي amplicon الجينات التسلسل، والذي هو حاليا الوسيلة الأكثر فعالية من حيث التكلفة لتعيين شامل التصنيف البكتيرية وأداء الكمي النسبي. وتشمل طرق بديلة استهدف QPCR 7، microarr مخصصةآيس 8، وكامل تسلسل الجينوم 9. الجينات 16S الريباسي يحتوي على تسعة منطقة التغير الزائد، وليس هناك توافق في الآراء بشأن المنطقة V المثلى لتسلسل للدراسات microbiome المهبل. نحن هنا استخدام مجموعة التمهيدي 515F / 806R وبناء على خط الانابيب الذي صممه Caporaso وآخرون. 10-12. Caporaso الصورة وآخرون. 515F / 806R مجموعة التمهيدي يمكن مضاعفة مئات العينات على المدى تسلسل واحد نظرا لتوافر الآلاف من الاشعال barcoded التحقق من صحة والتوافق مع منصات التسلسل البورشيد. وخلافا للوضع 27F / 338R التمهيدي مشروع Microbiome الإنسان البالغ عددهم 13، 515F / 806R أيضا يزيد من فعالية Bifidobacteriaceae ويلتقط بالتالي بدقة الغاردنريلة المهبلية، وهو عضو مهم في المجتمع الميكروبي المهبل لدى بعض النساء. بدلا من ذلك، تم استخدام زوج التمهيدي 338F / 806R بنجاح لسلسلة البايرو عينات مهبلية 14 وزوج التمهيدي 515F / 926R ديه RECEأصبح ntly متاحة للجيل المقبل من تسلسل 12.
وأخيرا، يقدم هذا البروتوكول التعليمات الأساسية لأداء 16S تحليل amplicon باستخدام رؤى الكمي في إيكولوجيا الجرثومية (QIIME) مجموعة من البرامج (15). نجاح تنفيذ الأوامر QIIME الموصوفة هنا غلة جدول يحتوي على تركيزات التصنيفية البكتيرية لكل عينة. العديد من خطوات إضافية لمراقبة الجودة وطرق تصنيف التصنيفية، وخطوات تحليل يمكن إدراجها في التحليل، كما هو موضح في التفاصيل على موقع QIIME (http://qiime.org/index.html). إذا كان سيتم إجراء تحليل على جهاز كمبيوتر أبل، وحزمة MacQIIME 16 على سهولة التركيب من QIIME وتبعياته. وتشمل حزم البرامج البديلة ل16S الريباسي تحليل تسلسل الجينات Mothur 17 و 18 UPARSE.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد وتوصيف وفرة البكتيرية النسبية داخل مسحة مهبلية الإنسان. يمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول بالنسبة للأنواع الأخرى عينة، مثل البراز ومسحات من مواقع أخرى من الجسم، والعينات التي تم جمعها من مجموعة واسعة من المصادر. استخراج الحمض النووي التي كتبها حبة الضرب في حل مخزنة من الفينول وكلوروفورم يسمح لعزل كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي، وهو أمر مهم بشكل خاص عند العمل مع العينات الثمينة التي تم جمعها من خلال الدراسات السريرية. الحمض النووي للبكتيريا معزولة ممتاز لتحديد التصنيف البكتيرية والتجمع الجيني، في حين جمع في وقت واحد من الحمض النووي الريبي يوفر فرصة لتحديد بكتيريا وظيفية، المضيفة، والمساهمات الفيروسية من خلال الحمض النووي الريبي يليها. يستخدم بروتوكول صفها على التحقق من صحة مجموعة التمهيدي من خطوة واحدة التي تم نشرها بنجاح على مجموعة واسعة من أنواع العينات، بما في ذلك الإنسان، والكلاب، والعينات البيئية 10 </suص>. توفر الآلاف من الاشعال barcoded يمكن مضاعفة العينات وفورات هائلة في التكاليف التسلسل. التكلفة الكاملة (بما في ذلك جميع المواد الكيميائية، تشغيل تسلسل واحد، والاشعال ولكن ليس المعدات) حوالي 20 $ لكل عينة عندما يتداخل 200 عينة. بالإضافة إلى ذلك، هناك استنساخ عالية جدا عند معالجة مسحات متعددة من نفس الموقع عينة بشكل مستقل من خلال خط أنابيب بأكمله. وعموما، فإن تكلفة بروتوكول يتسم بالكفاءة والمرونة، يمكن الاعتماد عليها، وتكرار.
والنووي جزء استخلاص الحمض من هذا البروتوكول هو محدود من احتياطات السلامة اللازمة عند التعامل مع الفينول والكلوروفورم، وتحديات أتمتة خط أنابيب إلى الإنتاجية العالية، وشكل لوحة 96-جيدا. بالإضافة إلى ذلك، حبة الضرب قوية تستخدم لمقص تحلل الميكانيكية الحمض النووي البكتيري إلى ما يقرب من 6 أجزاء كيلو قاعدة. إذا كانت هناك حاجة شظايا الحمض النووي أطول لتطبيقات المصب، مدة حبة الضرب الصورةيمكن اختصار hould معها. القيود المفروضة على جزء تحديد البكتيريا من هذا البروتوكول هي ملازمة لأي الطريقة التي تعتمد على التسلسل الجيني 16S الريباسي. 16S الريباسي التسلسل مثالية لتحديد البكتيريا إلى مستوى جنس وحتى الأنواع، ولكن نادرا ما توفر لهم تحديد مستوى الضغط. في حين أن المنطقة المتغيرة V4 من الجينات 16S الريباسي توفر التمييز القوي بين معظم الأنواع البكتيرية 11، قد تحتاج إلى استخدامها لتحديد بالضبط أنواع معينة، مثل crispatus الملبنة طرق حسابية إضافية مثل Oligotyping 31. أخيرا، معلومات عن القدرات الوظيفية البكتيرية دقيقة ضمن عينة معينة لا يمكن تحديده من خلال 16S الريباسي التسلسل الجيني وحده، رغم أن هذا البروتوكول يتيح استخراج الحمض النووي الجينوم بأكمله والحمض النووي الريبي التي يمكن استخدامها لتحقيق هذا الغرض.
الخطوة الأكثر أهمية لضمان نجاح مع هذا البروتوكول هو رعاية كبيرة لمنع التلوث الدرجي جمع العينات، واستخراج الحمض النووي، وPCR التضخيم. ضمان العقم عند جمع العينات من خلال ارتداء قفازات نظيفة واستخدام مسحات معقمة والأنابيب، ومقص. لتقييم لتلوث المواد جمع، وجمع مسحات سيطرة سلبية عن طريق وضع مسحة غير المستخدمة إضافية مباشرة في أنابيب النقل في وقت أخذ العينات. في المختبر، وتنفيذ كافة الخطوات قبل التضخيم في غطاء معقمة تحتوي على المواد فقط تطهير واستخدام درجة الجزيئي الوحيد، الكواشف خالية من الحمض النووي. خلال استخلاص الحمض النووي، ومنع انتقال التلوث باستخدام ملقط معقم جديدة وقفازات جديدة مع كل عينة، وحفظ جميع أنابيب مغلقة إلا في الاستخدام. تجهيز مسحات غير المستخدمة بالتوازي يضمن عقم كل من جمع العينات واستخلاص الحمض النووي. يجب مسحات غير المستخدمة لا تسفر عن بيليه بعد هطول الأمطار الأيسوبروبانول وغسل الايثانول. إذا لم تظهر بيليه، نفذ 16S الريباسي التضخيم الجيني لتحديد مصدر محتمل للالتلوث (على سبيل المثال، فإن وجود بكتيريا المكورات العنقودية أو تشير إلى تلوث الجلد). بالإضافة إلى ذلك، نفذ التكبير PCR مع عدم وجود ردود فعل تحكم قالب بالتوازي مع ضمان الكواشف PCR وردود الفعل لم تكن ملوثة. إذا ظهرت الفرقة في السيطرة على أي قالب، تجاهل الكواشف وتكرار التضخيم مع الكواشف جديدة. سوف اتخاذ هذه الاحتياطات ضمان تسلسل الناجح للبكتيريا من الفائدة.
الخطوة التضخيم PCR تميل إلى تتطلب معظم استكشاف الأخطاء وإصلاحها. تضخيم في مجموعات من اثني عشر عينات يوفر التوازن بين الكفاءة والاتساق. الغياب الكامل للفرق في جميع العينات في مجموعة التضخيم نظرا إلى وجود فشل منهجي، على سبيل المثال، وينسى لإضافة كاشف أو برمجة thermocycler بشكل غير صحيح. ومن المقرر عادة إلى خطأ بشري لعدم وجود فرقة من بعض العينات، والتكبير ينبغي إعادة صالامم المتحدة مع نفس المزاوجة بين العينة والتمهيدي عكسي. في حالة استمرار عدم وجود الفرقة، وعينة يمكن إعادة تضخيم باستخدام التمهيدي العكسي مع الباركود مختلفة. فشل التضخيم المتكررة مع الاشعال عكس متعددة قد تشير إلى وجود المانع في العينة. في هذه الحالة، وتنظيف الحمض النووي مع عمود في كثير من الأحيان إزالة مثبطات دون تغيير ملحوظ فرة البكتيرية النسبية. إذا نطاقات متعددة تنتج بعد التضخيم، وإعادة تضخيم عينة مع مختلف الباركود التمهيدي عكسي.
بالإضافة إلى منع التلوث البيئي وضمان التضخيم من منتج معين واحد، ويعتمد التسلسل الناجح على الرعاية عند إعداد تجمع المكتبة. والهدف هو الجمع بين كميات متساوي المولية من amplicons كل عينة لضمان تقريبا نفس العدد من التسلسل يقرأ في العينة. إذا كان تركيز الحمض النووي قبل التضخيم قابلة للمقارنة، ببساطة بإضافة كميات متساوية من كل ساamplicons mple هي كافية عند إنشاء تجمع المكتبة. ومع ذلك، إذا كان تركيز الحمض النووي هي مختلفة إلى حد كبير، وأضاف في حجم مساو، على عينة مع تركيز منخفض الحمض النووي سوف تكون ممثلة تمثيلا ضعيفا مع عدد قليل من يقرأ. في هذه الحالة، فمن الممكن لإضافة عدد أكبر من amplicons من العينة تركيز منخفض على أساس الكثافة النسبية للفرقة هلام. بدلا من ذلك، فمن الممكن لإزالة أكثر صرامة الاشعال من amplicons الفردية وقياس تركيز amplicon عينة الفردية في استخدام فلوروميتريك عدة dsDNA الكمي، وعلى وجه التحديد تجمع كميات متساوي المولية من كل عينة.
مرة واحدة يتم إنشاء تجمع amplicon متوازن، يصبح من المهم جدا قياس بعناية تركيز على حمام السباحة و. تخفيف دقيق لاحق وارتفاع في مع PhiX لزيادة تعقيد قراءة هو أمر حاسم لتحقيق نتائج التسلسل الأمثل. التعاقب الإنتاجية العالية التي تستخدم sequenالوراثة عن طريق التخليق حساسون جدا لكثافة الكتلة على الخلية التدفق. تحميل تجمع المكتبات التي يتركز جدا سيؤدي في overclustering، مع انخفاض درجات الجودة، وانخفاض إخراج البيانات، وdemultiplexing دقيقة 32. تحميل تجمع المكتبات التي يتم تمييع جدا سيؤدي أيضا في إخراج البيانات منخفضة. بعناية قياس تجمع مكتبة قبل التسلسل وضمان أفضل النتائج.
يوفر 16S الريباسي التسلسل الجيني لتقييم شامل من البكتيريا الموجودة في عينة معينة، وخطوة أولى في غاية الأهمية في توليد الفرضية. وجود مجموعة غنية من البيانات الوصفية مزيد تمكن الباحث لاختبار الارتباط بين سيما الأنواع البكتيرية والعوامل البيولوجية الهامة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نفس 16S المعلومات للاستدلال على وظائف البكتيرية باستخدام أدوات مثل PICRUSt 33. والهدف النهائي هو استخدام 16S توصيف لتحديد الاتحادات الرواية التي يمكن أن تكونمزيد من الاختبارات والتحقق من صحتها في نظم نموذج، إضافة إلى فهمنا متزايد من تأثير microbiome البكتيريا على صحة الإنسان والمرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر إليزابيث بيرن، ديفيد Gootenberg، وكريستينا Gosmann لردود الفعل الحاسم على البروتوكول. ميغان Baldridge، سكوت هاندلي، سيندي موناكو، وجايسون نورمان لتوجيه إعداد العينات والمظاهرات. ويندي غاريت، كورتيس Huttenhower، اقفز العذراء، وبروس ووكر للحصول على المشورة البروتوكول ومناقشات مثمرة. وجيسيكا Hoisington لوبيز لدعم التسلسل. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا وNIAID (1R01AI111918). تلقى DSK دعم إضافي من صندوق ويلكوم بوروز. وأيد [منا من قبل عدد جائزة T32GM007753 من NIGMS، وبول وديزي سوروس زمالة. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للNIGMS أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Equipment: | |||
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
| Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
| Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
| MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
| ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
| SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
| 2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
| UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
| 1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
| 0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
| Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
| UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
| 2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
| Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
| Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
| 1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
| PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
| 0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
| Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
| 50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
| DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
| 50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
| AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
| UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers: | |||
| 515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
| Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
| Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |
References
- Huttenhower, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486, 207-214 (2012).
- O’Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. A. Vaginal pH and microbicidal lactic acid when lactobacilli dominate the microbiota. PloS one. 8, e80074 (2013).
- Aldunate, M. Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).
- Anahtar, M. N., et al. Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract. Immunity. 42, 965-976 (2015).
- Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Srinivasan, S., et al. Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis. PloS one. 5, e10197 (2010).
- Dols, J. A., et al. Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis. American journal of obstetrics and gynecology. 204, 301-307 (2011).
- Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature methods. 9, 811-814 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4516-4522 (2011).
- Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4680-4687 (2011).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PloS one. 7, e37818 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature. 10, 996-998 (2013).
- AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen Available from: https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/ (2015)
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf (2008)
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data. GigaScience. 2, 16 (2013).
- Eren, A. M., et al. Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation. PloS one. 6, e26732 (2011).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).
