Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung
Summary
Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.
Abstract
Es gibt eine wachsende Wertschätzung für die Rolle der mikrobiellen Lebensgemeinschaften als kritische Modulatoren der menschlichen Gesundheit und Krankheit. Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien für die schnelle und effiziente Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften verwenden 16S rRNA-Gen-Sequenzierung aus einer Vielzahl von Quellen erlaubt. Obwohl leicht verfügbaren Werkzeuge für die 16S rRNA-Analyse-Sequenz standardisierte Rechen Workflows haben, bleibt Probenverarbeitung zur DNA-Extraktion über Studien, die eine Fortsetzung Quelle der Variabilität. Hier beschreiben wir eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern extrahieren. Wir beschreiben auch Downstream-Methoden für 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung, einschließlich der Erzeugung von Sequenzierungsbibliotheken, Datenqualitätskontrolle und Sequenzanalyse. Die Workflow kann mehrere Proben-Typen, einschließlich Stuhl und Tupfer aus einer Vielzahl von anatomischen Stellen und Wirtsarten gesammelt zubringen. Zusätzlich gewonnene DNA und RNA abgetrennt und verwendet werden,für andere Anwendungen, einschließlich vollständige Genomsequenzierung oder RNA-Seq. Das beschriebene Verfahren erlaubt einen gemeinsamen Ansatz bei Verarbeitung für mehrere Probentypen und bietet Platz für Downstream-Analyse genomischer, Metagenom und Transkriptions Informationen.
Introduction
Der menschliche unteren Reproduktionstrakts, des gastrointestinalen Systems, des Atmungstrakts und der Haut werden durch komplexe Bakteriengemeinschaften besiedelt , die für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und Unterstützung der Gesundheit des Wirtes 1 entscheidend sind. Zum Beispiel eine unwirtliche Umgebung für Pathogene bestimmte Laktobazillen erstellen , indem Sie das Scheidengewölbe Versauerung, die Herstellung von antimikrobiellen Effektoren und Modulation lokalen Host Immunität 2-4. Die wachsende Wertschätzung für die Bedeutung der bakteriellen microbiome hat auch Interesse erhöht bei der Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften in vielen klinischen Kontexten. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Zusammensetzung der bakteriellen microbiome aus Genitalabstrichen zu bestimmen. Das Protokoll kann leicht für Hocker und Tupferproben aus anderen anatomischen Stellen und anderen Wirtsarten gesammelt modifiziert werden.
Aufgrund der inhärenten Einschränkungen bei der Anzahl der Proben, die von einem gegebenen Bolzen gesammelt und gespeichert werden können,y Teilnehmer wurde dieses Protokoll zu extrahieren , DNA, RNA, entworfen und möglicherweise sogar Protein aus einem einzigen Tupfer eine angepasste Phenol-Chloroform basierend sicken Schlagen Verfahren 5,6. Die Kombination der physikalischen Störung der bakteriellen Zellwände mit sicken Schlagen und chemische Störung mit Detergenzien ermöglicht eine schnelle Lyse von Gram-positive, Gram-negative und säurefeste Bakterien ohne zusätzliche enzymatische Verdauung Schritte. Um eine hohe Qualität RNA zu erhalten, wird empfohlen, trockenen Tupfer zu verwenden, die bei oder unter 4 ° gehalten wurden C unmittelbar nach der Entnahme und beim Transport in das Labor (falls zutreffend) und gespeicherte Langzeit bei -80 ° C.
Um die bakterielle microbiome innerhalb einer gegebenen Probe zu bestimmen, ist dieses Verfahren nutzt 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierung, die derzeit die kostengünstigste Mittel zur umfassenden bakteriellen Taxonomie zuordnen und relative Quantifizierung durchzuführen. Alternative Verfahren umfassen qPCR gezielte 7, kundenspezifische microarrays 8 und Vollgenomsequenzierung 9. Das 16S-rRNA-Gen enthält neun hypervariablen Regionen, und es gibt keinen Konsens über die optimale V-Region in Bezug auf die für die vaginale microbiome Studien zu sequenzieren. Hier verwenden wir die 515F / 806R Primer – Set und bauen auf die Pipeline entworfen von Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. 'S 515F / 806R Primer – Set ermöglicht Multiplexing von Hunderten von Proben auf einer einzigen Sequenzierungslauf aufgrund der Verfügbarkeit von Tausenden von validierten barcodierte Primer und die Kompatibilität mit Illumina – Sequenzierung Plattformen. Im Gegensatz zu den 27F / 338R Primer Human Microbiome Projekt 13 gesetzt, 515F / 806R verstärkt auch Bifidobacteriaceae effektiv und damit fängt genau Gardnerella vaginalis, ein wichtiges Mitglied der vaginalen mikrobiellen Gemeinschaft in einigen Frauen. Alternativ ist seit Pyrosequenzierung der vaginalen Proben 14 und ein 515F / 926R Primerpaar ein 338F / 806R Primerpaar erfolgreich hat rece verwendetntly verfügbar werden für die nächste Generation – Sequenzierung 12.
Schließlich bietet dieses Protokoll grundlegende Anweisungen 16S Amplikon – Analyse durchzuführen , die quantitativen Insights mit in Microbial Ecology (QIIME) Software – Paket 15. Die erfolgreiche Umsetzung der QIIME Befehle beschrieben hier ergibt sich eine Tabelle für jede Probe Bakterien taxonomischen Abundanzen enthält. Viele zusätzliche Qualitätskontrollschritte, taxonomische Klassifizierung Methoden und Analyseschritte können in die Analyse einbezogen werden, wie es im Detail auf der QIIME Website beschrieben (http://qiime.org/index.html). Wenn die Analyse auf einem Apple – Computer ausgeführt werden, 16 das MacQIIME – Paket bietet eine einfache Installation von QIIME und ihre Abhängigkeiten. Alternative Software – Pakete für die 16S rRNA – Gen – Sequenzanalyse umfassen Mothur 17 und UPARSE 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Identifizierung und Charakterisierung der relativen bakteriellen Häufigkeiten innerhalb eines menschlichen vaginaler Abstrich. Dieses Protokoll kann leicht für andere Probentypen, wie Stuhl und Tupfer anderer Körperstellen angepaßt werden, und für Proben aus einer Vielzahl von Quellen gesammelt. Die Extraktion von Nukleinsäure von sicken Schlagen in einer gepufferten Lösung von Phenol und Chloroform ermöglicht die Isolierung von sowohl DNA als auch RNA, die besonders wichtig ist, wenn sie mit wertvollen Proben gesammelt durch klinische Studien zu arbeiten. Die isolierte bakterielle DNA eignet sich hervorragend für bakterielle taxonomische Identifizierung und genomische Montage, während die gleichzeitige Sammlung von RNA die Möglichkeit bietet, funktionelle bakterielle Wirt und Virus-Beiträge durch RNA-seq zu bestimmen. Das beschriebene Protokoll basiert auf einer validierten Ein-Schritt – Primer – Set , das auf einer Vielzahl von Probenarten erfolgreich eingesetzt wurde, einschließlich Mensch, Hund und Umweltproben 10 </sup>. Die Verfügbarkeit von Tausenden von barcodierte Primer ermöglicht Multiplexing von Proben und enorme Einsparungen bei den Sequenzierungskosten. Der komplette Kosten (einschließlich aller Reagenzien, einer einzigen Sequenzierungslauf und Primer aber nicht Ausrüstung) ist etwa 20 $ pro Probe bei 200 Proben gemultiplext werden. Zusätzlich gibt es eine sehr hohe Reproduzierbarkeit wenn mehrere Tupfer aus der gleichen Probenstelle unabhängig durch die gesamte Pipeline verarbeitet werden. Insgesamt ist das Protokoll, kosteneffizient, flexibel, zuverlässig und wiederholbar.
Die Nukleinsäureextraktion Teil dieses Protokolls wird durch die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen begrenzt, wenn mit Phenol und Chloroform zu arbeiten, und die Herausforderungen, die Pipeline zu einem hohen Durchsatz zu automatisieren, 96-Well-Plattenformat. Zusätzlich wird die kräftige Wulst Schläge für die mechanische Lyse Schere die bakterielle DNA auf ca. 6 kb Fragmente verwendet; wenn längere DNA-Fragmente werden für Downstream-Anwendungen erforderlich, die Dauer der Wulst Schlagen should verkürzt werden. Die Beschränkungen des Bakterienidentifizierungs Teil dieses Protokolls sind inhärent für jede Methode, die auf 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung beruht. 16S-rRNA-Sequenzierung ist für die Identifizierung von Bakterien, die zur Gattung und sogar Artniveau ideal, aber nur selten bietet Verformungspegel Identifikation. Während die V4 variable Region der 16S – rRNA – Gen unter den meisten Bakterienarten 11, zusätzliche Rechenverfahren wie Oligotyping 31 robust Diskriminierungs bietet müssen genau verwendet werden , um bestimmte Arten, wie Lactobacillus crispatus identifizieren. Schließlich Informationen über die genaue bakterielle funktionellen Fähigkeiten in einer bestimmten Probe kann nicht allein durch die 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bestimmt werden, obwohl dieses Protokoll Extraktion von whole genome DNA und RNA ermöglicht, die zu diesem Zweck verwendet werden können.
Der kritischste Schritt zur Gewährleistung Erfolg mit diesem Protokoll wird unter großer Sorgfalt Kontamination zu verhindern during Probensammlung, Nukleinsäure-Extraktion und PCR-Amplifikation. Stellen Sie sicher, Sterilität zum Zeitpunkt der Probenentnahme durch saubere Handschuhe tragen und mit sterilen Tupfern, Röhren und Schere. Um eine Kontamination der Sammlung Materialien beurteilen zu können, sammeln negative Kontrolltupfer, indem zusätzliche nicht verwendeten Tupfer direkt in Transportröhren zum Zeitpunkt der Probenahme. Im Labor führen alle Vorverstärkung Schritte in einem sterilisierten Haube nur dekontaminiert liefert und nur mit molekularen, DNA-freie Reagenzien enthält. Während die Nukleinsäureextraktion, verhindern eine Kreuzkontamination durch den Einsatz neuer sterilen Pinzette und frische Handschuhe mit jeder Probe, und halten Sie alle Rohre, es sei denn im Gebrauch geschlossen. Die Verarbeitung nicht verwendeten Tupfer parallel sorgt für Sterilität sowohl der Probensammlung und Nukleinsäure-Extraktion; die nicht verwendeten Tupfer sollte nicht ein Pellet nach Isopropanol-Fällung und Ethanol Waschen erhalten. Wenn ein Pellet angezeigt wird, führen 16S-rRNA-Gen-Amplifikation eine mögliche Quelle zu bestimmen,die Verunreinigung (zB würde das Vorhandensein von Streptococcus oder Staphylococcus Kontamination der Haut zeigen). Zusätzlich führen PCR Amplifikationen ohne Templat Kontrollreaktionen in parallel, um sicherzustellen, dass die PCR-Reagenzien und Reaktionen sind nicht kontaminiert worden ist. Wenn ein Band in einem keine Vorlage Steuerung angezeigt wird, um die Reagenzien zu verwerfen und die Amplifikation mit frischen Reagenzien wiederholen. Diese Vorsichtsmaßnahmen werden erfolgreiche Sequenzierung der Bakterien Interesse sicherzustellen.
Die PCR-Amplifikation Schritt neigt dazu, die meisten Problembehandlung erfordern. Amplifizierung in Gruppen von zwölf Proben stellt ein Gleichgewicht zwischen Effizienz und Konsistenz. Das vollständige Fehlen von Banden in allen Proben in einem bestimmten Verstärkung Satz deutet auf eine systematische Versagen, zum Beispiel vergessen , ein Reagens hinzuzufügen oder falsch den Thermocycler Programmierung. Das Fehlen einer Bande von einigen Proben ist in der Regel aufgrund von menschlichem Versagen und die Amplifikationen erneut r sollteun mit der gleichen Paarung von Probe und Reverse-Primer. Im Fall einer fortgesetzten Abwesenheit eines Bandes kann die Probe mit einem anderen Strichcode unter Verwendung eines reversen Primers erneut amplifiziert werden. Wiederholter Ausfall der PCR mit mehreren Reverse-Primer können einen Inhibitor in der Probe vorhanden zeigen. Inhibitoren entfernen, ohne signifikant zu verändern relativen Abundanzen bakteriellen In diesem Fall wird häufig die DNA mit einer Säule gereinigt wird. Wenn mehrere Bänder nach einer Verstärkung führen, wieder verstärken, um die Probe mit einem anderen Reverse-Primer-Barcode.
Zusätzlich zu einer Kontamination der Umwelt zu verhindern und sicherzustellen, Amplifikation eines einzelnen spezifischen Produkt, erfolgreiche Sequenzierung beruht auf Pflege, wenn die Bibliothek Pool vorbereitet. Das Ziel ist, äquimolare Mengen von jeder Probe des Amplicons zu kombinieren etwa die gleiche Anzahl von Sequenzierungs sicherzustellen pro Abtastwert liest. Wenn die Nukleinsäure-Konzentrationen vor der Verstärkung vergleichbar sind, das Hinzufügen einfach gleichen Volumina jeder sample des Amplikons ist ausreichend, wenn die Bibliothek Pool zu schaffen. Jedoch, wenn die Nukleinsäurekonzentrationen erheblich unterschiedlich sind und in gleichem Volumen, wobei die Probe mit der geringen Nukleinsäurekonzentration wird schlecht mit einer geringen Anzahl von Lesevorgängen dargestellt zugesetzt. In diesem Fall ist es möglich, ein höheres Volumen der Amplikons von der Niedrigkonzentrationsprobe von der relativen Intensität der Gel-Bande basierend hinzuzufügen. Alternativ ist es möglich, rigoroser Primern aus den einzelnen Amplifikaten entfernen, quantifizieren die einzelnen Proben Amplicon-Konzentration einen fluorimetrischen Quantifizierung dsDNA-Kit und genau äquimolaren Mengen jeder Probe kombinieren.
Sobald ein ausgewogenes Amplicon-Pool generiert wird, wird es von entscheidender Bedeutung, um sorgfältig die Konzentration des Pool messen. Im Anschluss vorsichtig Verdünnung und Spike-in mit PhiX erhöhen die Lese Komplexität für das Erreichen optimaler Sequenzierungsergebnisse kritisch ist. Hochdurchsatz-Sequenzern, die Sequen verwendencing durch Synthese sind in den Cluster-Dichte auf der Durchflusszelle sehr empfindlich. Laden einer Bibliothek Pool, der auch konzentriert in overclustering, mit geringerer Qualität Partituren, geringere Datenausgabe und ungenau Demultiplexen 32 führen wird. Laden eines Bibliothek-Pool, der auch bei niedrigen Datenausgang führt zu verdünnt wird. die Bibliothek Pool vor der Sequenzierung sorgfältig Quantifizierung werden optimale Ergebnisse zu gewährleisten.
16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bietet eine umfassende Beurteilung der vorhandenen Bakterien innerhalb einer gegebenen Probe und ist ein absolut entscheidender erster Schritt in Hypothesengenerierung. Das Vorhandensein einer umfangreichen Satz von Metadaten ermöglicht weiterhin die Forscher Assoziationen zwischen bestimmten Bakterienarten zu testen und wichtige biologische Faktoren. Darüber hinaus kann die gleiche 16S – Informationen verwendet werden , um die bakterielle Funktionen mit Werkzeugen ableiten wie PICRUSt 33. Oberstes Ziel ist es 16S Charakterisierung verwenden neue Assoziationen zu identifizieren, die sein könnenweiter getestet und in Modellsystemen validiert, zusätzlich zu unserem wachsenden Verständnis der Auswirkungen der bakteriellen microbiome auf die menschliche Gesundheit und Krankheiten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass Elizabeth Byrne, David Gootenberg und Christina Gosmann für kritisches Feedback über das Protokoll zu danken; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco und Jason Norman für die Probenvorbereitung Führung und Demonstrationen; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower Skip Virgin und Bruce Walker für die Protokoll-Rat und fruchtbare Diskussionen; und Jessica Hoisington-Lopez für die Sequenzierung Unterstützung. Die Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation, und die NIAID (1R01AI111918) nicht unterstützt. DSK erhielt zusätzliche Unterstützung vom Burroughs Wellcome Fund. MNA wurde von Verleihungsnummer T32GM007753 vom NIGMS, und der Paul und Daisy Soros Fellowship unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der NIGMS oder die NIH.
Materials
| Equipment: | |||
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
| Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
| Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
| MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
| ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
| SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
| 2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
| UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
| 1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
| 0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
| Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
| UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
| 2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
| Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
| Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
| 1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
| PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
| 0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
| Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
| 50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
| DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
| 50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
| AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
| UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers: | |||
| 515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
| Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
| Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |
References
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