Se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos para la caracterización de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de amplificación. El método permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y acomoda un número de procesos de análisis de aguas abajo.
Hay un interés creciente por el papel de las comunidades microbianas como moduladores críticos de la salud humana y la enfermedad. tecnologías de secuenciación de alto rendimiento han permitido la caracterización rápida y eficiente de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de una variedad de fuentes. Aunque las herramientas fácilmente disponibles para el análisis de secuencias de ARNr 16S tienen flujos de trabajo estandarizados de cálculo, procesamiento de muestras para la extracción de ADN sigue siendo una fuente continua de la variabilidad entre los estudios. Aquí se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos. También delineamos métodos aguas abajo para la secuenciación de genes 16S rRNA, incluyendo la generación de bibliotecas de secuenciación, el control de calidad de los datos, y análisis de secuencias. El flujo de trabajo puede alojar múltiples tipos de muestras, incluyendo las heces y torundas recogidos de una variedad de ubicaciones anatómicas y especies huésped. Además, se recuperó el ADN y el ARN se puede separar y utilizarpara otras aplicaciones, incluyendo la secuenciación de todo el genoma o RNA-seq. El método descrito permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y tiene capacidad para análisis de aguas abajo de la información genómica, metagenomic y transcripcional.
El tracto inferior humana reproductiva, sistema gastrointestinal, tracto respiratorio, la piel y son colonizados por comunidades bacterianas complejas que son críticos para el mantenimiento de la homeostasis del tejido y apoyar la salud del huésped 1. Por ejemplo, ciertos lactobacilos crear un ambiente inhóspito para los patógenos mediante la acidificación de la cúpula vaginal, la producción de efectores antimicrobianos y modulación de la inmunidad anfitrión local 2-4. El creciente reconocimiento de la importancia del microbioma bacteriana también ha aumentado el interés en la caracterización de las comunidades bacterianas en muchos contextos clínicos. Aquí se describe un método para determinar la composición de la microbiota bacteriana de hisopos genitales. El protocolo puede modificarse fácilmente para muestras de heces e hisopos recogidos de otras localizaciones anatómicas y otras especies huésped.
Debido a las limitaciones inherentes en el número de muestras que pueden ser recogidos y almacenados a partir de un determinado espárragoy participante, este protocolo se diseñó para extraer el ADN, el ARN, y, potencialmente, incluso la proteína de una sola torunda utilizando una adaptada fenol-cloroformo bead-latidos método basado en 5,6. La combinación de la interrupción física de las paredes celulares bacterianas con bead-golpeo y la alteración química con detergentes permite una rápida lisis de las bacterias Gram-positivas, Gram-negativas, y ácido-rápidos sin pasos adicionales de digestión enzimática. Para obtener ARN de alta calidad, se recomienda el uso de hisopos secos que se mantuvieron igual o inferior a 4 ° C inmediatamente después de la recolección y durante su transporte al laboratorio (si procede), y se almacena a largo plazo a -80 ° C.
Para determinar la microbiota bacteriana en una muestra dada, este procedimiento utiliza la secuencia 16S rRNA gen de amplificación, que es actualmente el medio más rentables para asignar exhaustiva taxonomía bacteriana y llevar a cabo la cuantificación relativo. Los métodos alternativos incluyen dirigidos qPCR 7, microarr personalizadaays 8, y la secuenciación de todo el genoma 9. El gen 16S rRNA contiene nueve regiones hipervariables, y no hay consenso con respecto a la región V óptima para secuenciar para estudios microbioma vaginal. Aquí se utiliza el conjunto de cebadores 515F / 806R y construimos en la tubería diseñada por Caporaso et al., 10-12. Caporaso et al. 'S conjunto de cebadores 515F / 806R permite la multiplexación de cientos de muestras en una única ejecución de secuenciación debido a la disponibilidad de miles de cebadores con código de barras validados y la compatibilidad con las plataformas de secuenciación de Illumina. A diferencia de imprimación 27F / Proyecto 338R del microbioma humano creado 13, 515F / 806R también amplifica eficazmente Bifidobacteriaceae y captura de este modo con precisión Gardnerella vaginalis, un miembro importante de la comunidad microbiana vaginal en algunas mujeres. Alternativamente, un par de cebadores 338F / 806R se ha utilizado con éxito para la pirosecuenciación de muestras vaginales 14 y un par de cebadores 515F / 926R tiene recently estén disponibles para la secuenciación de próxima generación 12.
Por último, este protocolo ofrece instrucciones básicas para llevar a cabo el análisis de 16S de amplificación usando los Insights cuantitativos en Ecología Microbiana (QIIME) paquete de software 15. La implementación exitosa de los comandos QIIME descritos aquí se obtiene una tabla que contiene las abundancias taxonómicos de bacterias para cada muestra. Muchas medidas adicionales de control de calidad, métodos de clasificación taxonómica, y pasos de análisis se pueden incorporar en el análisis, como se describe en detalle en la web QIIME (http://qiime.org/index.html). Si el análisis se llevará a cabo en un ordenador Apple, el paquete MacQIIME 16 proporciona una fácil instalación de QIIME y sus dependencias. Paquetes de software alternativos para 16S rRNA análisis de secuencias génica incluyen Mothur 17 y 18 UPARSE.
Aquí se describe un protocolo para la identificación y caracterización de las abundancias relativas de bacterias dentro de un hisopo vaginal humana. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para otros tipos de muestras, tal como heces y frotis de otras partes del cuerpo, y para muestras recogidas de una amplia variedad de fuentes. La extracción de ácido nucleico por bead-golpeo en una solución tamponada de fenol y cloroformo permite el aislamiento de DNA y RNA, que es particularmente importante cuando se trabaja con muestras preciosos recogidos a través de estudios clínicos. El ADN bacteriano aislado es excelente para la identificación taxonómica de bacterias y ensamblaje genómico, mientras que la recolección simultánea de ARN ofrece la oportunidad de determinar bacteriana funcional, el huésped y virales a través de las contribuciones de RNA-seq. El protocolo descrito utiliza un conjunto validado de un solo paso de imprimación que ha sido desplegado con éxito en una amplia gama de tipos de muestras, incluyendo humano, canino, y muestras ambientales 10 </sup>. La disponibilidad de miles de cebadores con código de barras permite la multiplexación de las muestras y los enormes ahorros en los costos de secuenciación. El costo total (incluyendo todos los reactivos, una sola carrera, secuenciación y cebadores, pero no equipos) es alrededor de $ 20 por muestra cuando se multiplexan 200 muestras. Además, no es muy alta reproducibilidad cuando varios hisopos del mismo sitio de la muestra se procesan de forma independiente a través de toda la tubería. En general, el protocolo es el costo eficiente, flexible, fiable y repetible.
La parte de extracción de ácido nucleico de este protocolo está limitado por las medidas de seguridad necesarias cuando se trabaja con fenol y cloroformo, y los desafíos de la automatización de la tubería a un alto rendimiento, formato de placa de 96 pocillos. Además, los vigorosos golpes de talón utiliza para cizallas mecánicas lisis del ADN bacteriano a aproximadamente 6 fragmentos de kilobases; si se requieren fragmentos de ADN más largos para aplicaciones posteriores, la duración del cordón latiendo should acortarse. Las limitaciones de la porción de identificación de bacterias de este protocolo son inherentes a cualquier método que se basa en la secuenciación del gen 16S rRNA. secuenciación del 16S rRNA es ideal para la identificación bacteriana a nivel de género e incluso las especies, pero rara vez proporciona la identificación a nivel de cepa. Mientras que la región variable V4 del gen 16S rRNA proporciona discriminación robusta entre la mayoría de especies bacterianas 11, pueden necesitar ser utilizado para identificar con precisión ciertas especies, tales como Lactobacillus crispatus métodos computacionales adicionales tales como oligotipificación 31. Finalmente, la información acerca de las capacidades funcionales bacterianas precisas dentro de una muestra particular no se puede determinar por secuenciación del gen 16S rRNA solo, aunque este protocolo permite la extracción de ADN de todo el genoma y ARN que puede ser utilizado para este propósito.
El paso más crítico para asegurar el éxito con este protocolo está tomando gran cuidado para evitar la contaminación during recogida de muestras, extracción de ácidos nucleicos, y la amplificación PCR. Asegure su esterilidad en el momento de la recogida de muestras con el uso de guantes limpios y el uso de hisopos estériles, tubos y tijeras. Para evaluar la contaminación de los materiales de la colección, recoger hisopos de control negativo mediante la colocación de hisopos adicionales no utilizadas directamente en tubos de transporte en el momento del muestreo. En el laboratorio, realizar todos los pasos de pre-amplificación en una campana esterilizada que contienen sólo suministros descontaminados y utilizando sólo de grado molecular, reactivos sin ADN. Durante la extracción de ácidos nucleicos, evitar la contaminación cruzada mediante el uso de las nuevas pinzas estériles y guantes nuevos con cada muestra, y el mantenimiento de todos los tubos cerrados a menos que esté en uso. El procesamiento de hisopos no utilizados en paralelo asegura la esterilidad tanto de la toma de muestras y extracción de ácidos nucleicos; los hisopos no utilizados no deben producir un sedimento después de la precipitación con isopropanol y lavado con etanol. Si aparece un sedimento, lleve a cabo la amplificación del gen 16S rRNA para determinar una posible fuente decontaminación (por ejemplo, la presencia de estreptococos o estafilococos indicaría contaminación de la piel). Además, realizar amplificaciones por PCR con reacciones de control de plantilla en paralelo para asegurar que los reactivos y las reacciones de PCR no han sido contaminados. Si aparece una banda en un control sin molde, desechar los reactivos y repetir la amplificación con reactivos frescos. Tomando estas precauciones se asegurará de secuenciación con éxito de las bacterias de interés.
La etapa de amplificación por PCR tiende a requerir más de solución de problemas. Amplificando en grupos de doce de muestras proporciona un equilibrio entre la eficiencia y la consistencia. La ausencia completa de bandas en todos las muestras en un conjunto de amplificación dado indica una falla sistemática, por ejemplo, haber olvidado agregar un reactivo o programación incorrecta el termociclador. La ausencia de una banda de unas pocas muestras es por lo general debido a un error humano, y las amplificaciones debe ser re-rONU con la misma apareamiento de muestra y cebador inverso. En el caso de ausencia continuada de una banda, la muestra puede ser re-amplificado utilizando un cebador inverso con un código de barras diferente. fallos de amplificación repetidas con múltiples cebadores inversos pueden indicar un inhibidor presente en la muestra. En ese caso, la limpieza de la DNA con una columna a menudo eliminar los inhibidores sin alterar significativamente la abundancia de bacterias relativos. Si hay varias bandas resultan después de la amplificación, re-amplificar la muestra con un código de barras cebador inverso diferente.
Además de prevenir la contaminación del medio ambiente y garantizar la amplificación de un único producto específico, la secuenciación de éxito se basa en el cuidado en la preparación de la piscina de la biblioteca. El objetivo es combinar cantidades equimolares de amplicones de cada muestra para asegurar aproximadamente el mismo número de secuenciación lee por muestra. Si las concentraciones de ácido nucleico antes de la amplificación son comparables, la simple adición de volúmenes iguales de cada saamplicones de MPLE es suficiente al crear el conjunto de la biblioteca. Sin embargo, si las concentraciones de ácido nucleico son muy diferentes y se añaden en un volumen igual, la muestra con la baja concentración de ácido nucleico estará mal representada con un bajo número de lecturas. En este caso, es posible añadir un mayor volumen de los amplicones de la muestra de baja concentración en base a la intensidad relativa de la banda de gel. Alternativamente, es posible eliminar de forma más rigurosa cebadores de los amplicones individuales, cuantificar la concentración de amplicón de muestra individual usando un kit de ADN de doble cadena cuantificación fluorométrica, y precisamente combinar cantidades equimoleculares de cada muestra.
Una vez que se genera una piscina amplicón bien equilibrado, se vuelve crítico para medir cuidadosamente la concentración de la piscina. La posterior dilución cuidadosa y con espiga-en PhiX para aumentar la complejidad de lectura es esencial para lograr resultados óptimos de secuenciación. secuenciadores de alto rendimiento que utilizan Sequencing por síntesis son muy sensibles a la densidad de clúster en la célula de flujo. Carga de una piscina de biblioteca que está demasiado concentrada dará lugar a overclustering, con niveles de calidad inferiores, menor producción de datos, y demultiplexación imprecisa 32. Carga de una piscina de biblioteca que está demasiado diluida también dará lugar a la salida de datos de baja. Con cuidado, la cuantificación de la piscina de la biblioteca antes de la secuenciación se asegurará resultados óptimos.
16S rRNA secuenciación de genes proporciona una evaluación exhaustiva de las bacterias presentes en una muestra dada y es un primer paso absolutamente crítico en la generación de hipótesis. La presencia de un rico conjunto de metadatos además permite al investigador para probar asociaciones entre especies bacterianas particulares y factores biológicos importantes. Además, el mismo 16S información puede utilizarse para inferir las funciones bacterianas usando con herramientas como PICRUSt 33. El objetivo final es utilizar 16S caracterización para identificar nuevas asociaciones que pueden sermás probado y validado en sistemas modelo, añadiendo a nuestra creciente comprensión del impacto de la microbiota bacteriana en la salud humana y la enfermedad.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Elizabeth Byrne, David Gootenberg, y Christina Gosmann de retroalimentación crítica en el protocolo; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Mónaco, y Jason Norman como guía de preparación de muestras y demostraciones; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgen, y Bruce Walker para el consejo de protocolo y fructíferos debates; Hoisington y Jessica-López por el apoyo secuenciación. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Bill y Melinda Gates y el NIAID (1R01AI111918). DSK recibió apoyo adicional del Fondo Burroughs Wellcome. MNA fue apoyada por varios premios T32GM007753 del NIGMS, y el Paul y Daisy Soros Fellowship. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de la NIGMS oa los NIH.
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
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Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |