Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

De studie protocol werd goedgekeurd door en volgde de richtlijnen van het Biomedical Research Ethics Committee van de Universiteit van KwaZulu-Natal (Durban, Zuid-Afrika) en het Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (2012P001812 / MGH, Boston, MA). 1. Winning van Total nucleïnezuur uit cervicovaginal Zwabbers Opmerking: Voer nucleïnezuur extracties in sets van 16 monsters of minder. Het protocol zoals hieronder geschreven veronderstelt monsters worden verwerkt in sets van 12. Als het uitvoeren van meerdere rondes van extracties, serieel nummer de winning partijen en nemen elk monster extractie batchnummer evenals andere monster informatie (onder andere metadata zoals de deelnemer ID-nummer, leeftijd , datum / tijd van wattenstaafje collectie, hormonale anticonceptie-type, de seksueel overdraagbare aandoening testresultaten, etc.) in tabel 1. Voorbereiding van de reagentia en zuurkast <li> Bereid een buffer bestaande uit 200 mM natriumchloride (NaCl), 200 mM Tris en 20 mM edetinezuur (EDTA) in 100 ml nuclease-vrij water. Filter-steriliseren van de oplossing door het door een 0,22 urn filter. Chill een monster van 10 ml van de buffer op nat ijs. De pH van de fenol: chloroform: isoamylalcohol (IAA) (25: 24: 1) tot pH 7,9 door toevoeging van 65 pl Tris alkalische buffer per 1 ml fenol, het mengsel schudden gedurende 2 min, en waarbij de twee fasen afzonderlijk hetzij natuurlijk, hetzij door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Let op: Fenol is giftig bij inslikken, bij inademing of bij contact met de huid en ogen. Inademen van rook vermijden. Draag ondoordringbare handschoenen, veiligheidsbril met zijschermen en een laboratoriumjas. Filter-steriliseer 25 ml 20% natriumdodecylsulfaat (SDS) door een 0,22 urn filter. Maak 5 ml porties van de gesteriliseerde SDS. Chill een 10 ml aliquot van isopropanol bij -20 ° C. Bereid een kraal pak slaag buis voor elk swab te verwerken door weging uit 0,3 g glasparels in een steriele 2 ml buis die geschikt is voor de bead beater. Verkrijgen swabs door middel van steekproeven de ectocervix met een steriel absorberend doekje. Onmiddellijk na het verzamelen, zet het staafje in een lege steriele cryovial, bewaren bij 4 ° C gedurende 1 tot 4 uur tijdens het transport naar het laboratorium, en meerdere maanden bewaren bij -80 ° C. Breng de swabs (opgenomen in de afzonderlijke buizen) om te worden verwerkt tot nat ijs. Bereid de biologische veiligheid kast (BSC). Gebruik een BSC met een "vingerhoedje" verbonden met het gebouw uitlaat goede verwijdering van vluchtige stoffen te waarborgen. Verwijder alle materialen uit de kap. Reinig alle oppervlakken van de kap met bleekmiddel, gevolgd door een ontsmettingsmiddel dat RNases, DNasen en DNA verwijdert op oppervlakken. Schoon alle volgende items gebracht in de kap bleekmiddel gevolgd door een nucleïnezuur ontsmettingsmiddel, zoals handschoenen. Gebruik verse RNase / DNase-vrije reagentia, zoals pipette tips, waar mogelijk. Tape een gesteriliseerde chemische biologisch zak aan de achterzijde van de kap. Alle droge afval dat fenol of chloroform moeten in deze zak voor de juiste beschikking gesteld worden. Plaats een steriele fles in de motorkap om vloeibaar afval dat fenol of chloroform te verzamelen. Fenol-chloroform extractie. In de kap, aan elke kraal slaan buis, voeg 500 pl buffer (uit stap 1.1.1), 210 ui 20% natriumdodecylsulfaat en 500 pl fenol: chloroform: IAA (25: 24: 1, pH 7,9 ). Breng de wattenprop het transport flacon in de kraal slaan buis met behulp van een nieuw paar steriel pincet. Grondig wrijf het wattenstaafje hoofd tegen de binnenwanden van de kraal slaan buis tenminste 30 sec. Re-cap het monster als u klaar bent. Als het uitvoeren van extracties uit meerdere swabs, veranderen handschoenen tussen elk monster. Koel het monster op ijs gedurende ten minste 10 min. Verwijder het wattenstaafje uit dekraal verslaan buis door het houden van het staafje handvat met steriel pincet terwijl u het wattenstaafje hoofd tegen de inwendige buiswand met een schone P200 tip. Gooi de doekjes in de droge chemisch afval zak. Opmerking: De "rakel" actie (het indrukken van het wattenstaafje hoofd) zal vloeistof bevrijden van de absorberende wattenstaafje en verhoging van de nucleïnezuur herstel. Plaats de kraal kloppende buis in de bead beater en gehomogeniseerd gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer de kraal slaan buis 3 min bij 6000 xg en 4 ° C om vuil pelleteren en scheiden de waterige fase en fenol. Breng de waterige fase (~ 500-600 ui) in een steriele 1,5 ml buis. Voeg een gelijk volume fenol: chloroform: IAA. Meng door inversie en kort vortexen. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 16.000 xg en 4 ° C. Breng de waterige fase naar een nieuwe steriele 1,5 ml buis. Conservatief en geen materiaal niet dragen van de interfase laag of de onderliggende fenolfase. Noteer het volume van de waterfase overgedragen. Sla de fenol fase voor toekomstige eiwit isolement. Voeg 0,8 volume isopropanol en 0,1 volume 3 M natriumacetaat (pH 5,5). Meng goed door inversie en kort vortexen. Precipiteren van het nucleïnezuur door koeling de buis bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur (tot O / N). Isopropanol neerslag en ethanol wassen Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij ongeveer 16.000 xg en 4 ° C. Gebruik een pipet zorgvuldig de supernatant te verwijderen, waardoor de pellet intact. Voeg 500 ul 100% ethanol. Los de pellet met zachte vortexen of pipetteren zonder het aanraken van de pellet. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 xg en 4 ° C. gooi de ethanol supernatant voorzichtig. Gebruik een pipet P10 zoveel mogelijk ethanol te verwijderen zonder de pellet te verstoren. Lucht droog de pellet bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Resuspendeer de pellet in 20 ul uLTRA zuiver 0,1x Tris-EDTA buffer. Laat het monster koelen op ijs gedurende 10 min en pipetteer herhaaldelijk volledige resuspensie waarborgen. Indien de pellet niet oplost, breng de buis een 40 ° C warmteblok gedurende maximaal 10 min te helpen oplossen. Meet de nucleïnezuurconcentratie met een spectrofotometer 19. Desgewenst gescheiden DNA van RNA toepassing van een kolom clean-up kit, volgens het protocol van de fabrikant 20. Bewaar het nucleïnezuur bij -80 ° C of doorgaan. 2. PCR amplificatie van het 16S rRNA gen V4 hypervariabele gebied Opmerking: Voer de PCR amplificatie in sets van 12 monsters of minder om het risico op contaminatie en menselijke fouten te minimaliseren. Als uitvoeren van meerdere ronden van amplificatie serieel nummer de amplificatie batches en nemen elk monster amplificatie batchnummer in tabel 1. voorbereiding of de reagentia en de PCR-afzuigkap Voeg de PCR amplificatie bedoelde informatie tabel 1, die als basis voor het toewijzingsbestand op sequentieanalyse fase dient. Verwijder alle materialen uit een PCR-kap en reinig de inwendige oppervlakken grondig met bleekwater, gevolgd door een ontsmettingsmiddel dat RNases, DNasen en DNA verwijdert. Zorg ervoor dat elke reagens en stuk van apparatuur (bijvoorbeeld pipetten) ontsmetten voordat u ze in de motorkap. Draag handschoenen vers gereinigd met een nucleïnezuur decontaminant aanvang van de werkzaamheden in de kap. Indien nodig verdunnen nucleïnezuurmatrijs tot 50 – 100 ng / ul met behulp van DNA-vrij en nuclease-vrij water. Dooi hoeveelheden van de 5x high-fidelity (HF) buffer, dNTPs en primers in de schone PCR motorkap. Voorzichtig vortex en centrifugeer alle oplossingen na ontdooien. Om vries-dooicycli en het risico van een besmetting te minimaliseren, aliquots van de HF 5x buffer, dNTPs en primers. Plaats eenclean benchtop koeler rek voor microcentrifuge buizen en een PCR-plaat koeler in de kap. Voor PCR reactie, bereidt de master mix door het combineren van 15,5 ui ultrazuiver water, 5 pl 5x HF-buffer, 0,5 pl dNTP's, 0,5 gl 515F voorwaartse primer, 0,75 gl 3% DMSO en 0,25 pl polymerase voor elke reactie. Verzamel alle reactie componenten in de koeler en voeg de polymerase laatste. Meng goed door pipetteren. Voeg twee extra monsters om de reactie te tellen bij de voorbereiding van de master mix, om rekening te houden pipetteren fouten. PCR reactie setup: Opmerking: Voer amplificaties in drievoud, wat betekent dat elk monster wordt versterkt in drie afzonderlijke 25 ul reacties. Voer een no-template water control met elke primer paar. Werk snel maar zorgvuldig, het vermijden van de invoering van elke vorm van verontreiniging. Label een 8-well strip met individuele caps en plaats in een PCR-koeler. Pipetteer 90 ul van master mix in de eerstegoed. Voeg 2 ul van de reverse primer (Supplemental File 1). Zorg ervoor dat u zorgvuldig let op de reverse primer barcode gebruikt met elk monster in tabel 1. Meng goed en breng 23 ul van master mix naar de vierde bron (de no-template controle). Voeg 2 ul water aan de vierde put. Voeg 6 ul van de juiste monster op de eerste ook. Meng goed en breng 25 ul naar de tweede put. tips veranderingen en dragen een 25 gl van de eerste en de derde put. Stevig cap elke goed, zorg ervoor dat niet aan de binnenkant van de putten of pet in het proces te raken. Herhaal dit voor elk monster. Voer PCR amplificatie Breng de strip buizen een thermocycler en het volgende programma: 30 sec bij 98 ° C, gevolgd door 30 cycli van 10 sec bij 98 ° C, 30 sec bij 57 ° C en 12 sec bij 72 ° C, gevolgd door een 10 minuten houden op 72 ° C en een Eindhandhavingstijdt 4 ° C. Voer de volgende stappen uit op een schone lab bench. Snel draaien de buizen om vloeistof op te vangen van de muren. Combineer drievoud PCR reacties van elk monster, met een totaal volume van 75 pi, in een steriele gelabelde buis. Ook de overdracht 25 ul van elk no-template controle in een aparte steriele buis. Nog niet amplicons van verschillende monsters te combineren. Validatie van succesvolle PCR amplificatie monsters door gelelektroforese. Bereid een 1,5% agarosegel (1,5 g agarose poeder in 100 ml 1x TAE buffer) met voldoende putten elke amplicon, water control, en ladder 21 te houden. Terwijl de gel hardt (ongeveer 30 min), voorbereiding van het monster voor elektroforese Voeg 1 ul van 6x laden kleurstof een nieuwe, gemerkte buis. Dat buis, voeg 5 ul van het amplicon en meng door pipetteren. Wanneer de gel heeft ingesteld, verwijdert u het kammen, plaatst u de gel in de elektroforese tank en vul de tank met 1x TAE buffer. </li> Om de eerste goed, voeg 5 ul van DNA ladder. Belasting 5 pi van het monster amplicon naar een andere put. Belasting 5 pi van de niet-matrijs amplicon een aparte goed. Ga verder als nodig is voor elk monster. Wanneer alle monsters zijn geladen, schuift u de tank deksel op zijn plaats en zet de krachtbron tot 120 V. Laat de gel te lopen voor 30 – 60 min. Bekijk hier de gel onder UV-licht. Controleer succesvolle versterking van elk monster door op te merken een sterke band rond 380 bp. Als er een dubbele band, re-versterken van het monster met een andere reverse barcode (Stap 2.3). Als er geen band helemaal, opnieuw amplificeren van het monster met behulp van dezelfde omgekeerde barcode of een nieuwe reverse barcode (stap 2,3). Als re-amplificatie is mislukt, kunnen PCR remmers aanwezig zijn in het monster, in welk geval het uitvoeren van een kolom gebaseerde DNA cleanup aan PCR remmers verwijderen. Opmerking: Succesvolle amplificatie niet mogelijk als het bacteriële DNA-concentratie in de ofiginal monster onvoldoende (<5 ng / ul). Controleer de reagenstekort besmetting met het vaststellen van de afwezigheid van een band in de niet-mal controle. Bewaar de resterende 70 pl amplicon bij -20 ° C. Gooi de resterende 20 ul van de no-template controle, ervan uitgaande dat het niet een band opleveren. 3. Bibliotheek Pooling en High-throughput sequencing Maak de amplicon zwembad met een gelijk volume combineren (2-5 pi) van elk amplicon in een enkele steriele buis. Indien de band uit een monster leek bijzonder zwak, voeg tweemaal het volume ten opzichte van de rest van de monsters. Verwijder de PCR primers van de amplicon zwembad met een PCR Clean-up kit volgens de instructies van de fabrikant 22. Voer de sanering met meerdere kolommen of de amplicon zwembad volume groter is dan 100 pl. Let op: Elke kolom heeft een 100 pl capaciteit. Bewaar de bibliotheek bij -20 & #176, C of doorgaan naar de volgende stap. Eventueel combineren de primer-vrije amplicon pools de uiteindelijke bibliotheek te maken. Bepaal de DNA concentratie van de bibliotheek met behulp van een spectrofotometer of fluorometrische systeem 23. Een 260/280 verhouding tussen 1,8-2,0 wijst op zuiver DNA. Verdun de bibliotheek 20 nM. Bevestigen de kwaliteit van de bibliotheek door visualiseren van een enkele band ongeveer 400 bp met behulp van een elektroforese instrument. Bevestigen de concentratie van de bibliotheek met behulp van een fluorometrische systeem 23. Voer een uiteindelijke 1:10 verdunning in water om de bibliotheek te verdunnen tot 2 Nm. Vervolgens Bewaar de bibliotheek bij 20 ° C oneindig. Stuur een hoeveelheid van de uiteindelijke bibliotheek met de drie vereiste sequencing primers (schrijf 1, Lees 2 en index, tabellen of Materials / Equipment) te sequeneren op Illumina sequencer. Als er minder dan 300 monsters zijn gemultiplext voor sequencing, gebruik maken van een single-end 300 bp lopen en met een 12 bp index lezen ona MiSeq, met een definitieve bibliotheek concentratie van 5:00 en een 10% gedenatureerde PhiX spike-in. Zie de aanvullende materialen van Caporaso et al. ISME J, 2012 10 voor gedetailleerde instructies sequencing. 4. Sequence Analysis Let op: hier geschetste is een fundamenteel pijpleiding voor sequentie-analyse met behulp van de QIIME 1.8.0 softwarepakket. Voor de eenvoud, de verstrekte opdrachten aannemen dat de mapping bestand heet mapping.txt, de 12 bp index lezen bestand heet index.fastq, en de 300 bp sequencing lezen bestand heet sequences.fastq. Installeer QIIME of MacQIIME 16 en vertrouwd te maken met de basisprincipes van UNIX om deze opdrachten uit te voeren. Lees de complete gids voor QIIME bij: Vul het toewijzingsbestand het experiment (tabel 1). Sluiten zoveel mogelijk metadata. Let op welke monsters zijn gewonnen of versterkt in dezelfde batch, om vast te stellen of er sprake is batch-effecten. <li> Save the mapping bestand als een tekstbestand, bijvoorbeeld mapping.txt. Valideren van de opmaak van de mapping file door het uitvoeren van het volgende commando: validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o mapping_output Opmerking: Deze opdracht maakt gebruik van de ingebouwde "validate_mapping_file.py" QIIME script dat een nieuwe map, genaamd "mapping_output" maakt, met daarin een HTML-bestand met vermelding van de mapping-bestand fouten, indien aanwezig. Controleer de kwaliteit van de sequencing leest met behulp van een high-throughput-sequentie data kwaliteitscontrole programma, zoals FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Figuur 5 toont de per basensequentie kwaliteit die kunnen worden verwacht van een succesvolle run. Opmerking: De sequencer wijst elk nucleotide base een Phred kwaliteit score die overeenkomt met de waarschijnlijkheid dat de basis ten onrechte is genoemd. Een Phred kwaliteit score van 10 geeft aan dat er een kans van 10% dat de nucleotide verkeerd is geweest toewijzened, 20 duidt op een kans van 1%, 30 duidt op een kans van 0,1%, en 40 (de hoogst mogelijke score) geeft een kans van 0,01% 24. Met behulp van de mapping bestand als een sleutel, demultiplex, kwaliteit filter instellen voor het sequencing data, en de resultaten opslaan in een map (in dit geval, de zogenaamde "sl_out") door het uitvoeren van dit commando 25: split_libraries_fastq.py –rev_comp_mapping_barcodes -i sequences.fastq -o sl_out / -b index.fastq -m mapping.txt -q 29 Opmerking: De q vlag geeft de maximale onaanvaardbare Phred kwaliteit score, bijvoorbeeld, "q 29" filtert elke sequenties met Phred scores lager dan 30, zorgen voor 99,9% nauwkeurigheid van de basis gesprekken. Met behulp van de Greengenes 16S operationele taxonomische eenheid (OTU) referentiedatabank 26 (http://qiime.org/home_static/dataFiles.html), het uitvoeren van open verwijzing OTU plukken door het uitvoeren van dit commando 27: pick_open_reference_otus.py -i sl_out / seq. fna -r 97_otus.fasta -o ucrss / -s 0,1 Opmerking: de -s vlag geeftde fractie van sequenties die niet aan te passen aan het referentiedatabase die worden opgenomen in de de novo clustering. "-s 0,1" omvat 10% van de mislukte sequenties in de de novo clustering. Gebruik de -a vlag om de OTU picking-proces in parallel en vermindering van de doorlooptijd van dagen naar uren als er meerdere cores beschikbaar zijn. Maak een gebruiksvriendelijke taxonomische overvloed tafel door het samenvoegen van OTU de soortnaam worden door het uitvoeren van dit commando 28: summarize_taxa.py -i ucress / otu_table_mc2.biom -o summarized_otuSpecies / L 7 Opmerking: De resulterende tabel kan gemakkelijk worden bekeken in een spreadsheet software. Merk op dat 16S rRNA sequencing niet op betrouwbare wijze te voorzien soort niveau resolutie. Bepaal de ecologische diversiteit binnen elk monster door het berekenen van een aantal alpha diversiteit metrics met de QIIME script alpha_diversity.py. Vervolgens bepalen de diversiteit tussen paren van monsters met behulp van de QIIME script beta_diversity.py. Visualize de gegevens, bijvoorbeeld door het gebruik van een keizer 29 principal coördineert plot of heatmap. Voer formele statistische vergelijkingen van mapping categorieën bestand, bijvoorbeeld met QIIME's compare_catagories.py script 30.