Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização
Summary
Nós descrevemos um método eficiente, robusto e de baixo custo para extração de ácidos nucleicos de cotonetes para a caracterização das comunidades bacterianas usando 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento. O método permite uma abordagem comum para processamento de múltiplos tipos de amostras e acomoda uma série de processos analíticos jusante.
Abstract
Existe uma crescente valorização para o papel das comunidades microbianas como moduladores críticos da saúde humana e doenças. tecnologias de sequenciação de alto rendimento têm permitido a caracterização rápida e eficiente de comunidades bacterianas usando rRNA 16S de sequenciação de genes a partir de uma variedade de fontes. Embora ferramentas prontamente disponíveis para seqüenciamento do gene 16S rRNA têm fluxos de trabalho computacionais padronizadas, processamento de amostras para extração de DNA continua a ser uma fonte contínua de variabilidade entre os estudos. Aqui nós descrevemos um método eficiente, robusto e rentável para extrair ácidos nucleicos a partir de esfregaços. Também delinear métodos jusante para sequenciamento de genes 16S rRNA, incluindo a geração de bibliotecas de sequenciamento, controle de qualidade de dados e análise de sequência. O fluxo de trabalho pode acomodar vários tipos de amostras, incluindo fezes e suabes coletados a partir de uma variedade de locais anatômicos e espécies hospedeiras. Além disso, recuperou ADN e ARN podem ser separados e utilizadospara outras aplicações, incluindo a sequenciação do genoma total ou RNA-seq. O método descrito permite uma abordagem processamento comum para vários tipos de amostras e acomoda análise a jusante da informação genómica, metagenômica e transcrição.
Introduction
O ser humano inferior trato reprodutivo, sistema gastrointestinal, trato respiratório e da pele são colonizados por comunidades bacterianas complexas que são fundamentais para a manutenção da homeostase do tecido e apoiar a saúde do hospedeiro 1. Por exemplo, certa lactobacilos criar um ambiente inóspito para patógenos por acidificação da cúpula vaginal, produzindo efetores antimicrobianos e modulação da imunidade host local 2-4. A apreciação crescente para a importância do microbioma bacteriana também tem aumentado o interesse na caracterização de comunidades bacterianas em muitos contextos clínicos. Aqui nós descrevemos um método para determinar a composição do microbioma bacteriano a partir de esfregaços genitais. O protocolo pode ser facilmente modificado para amostras de fezes e suabes coletados de outras localizações anatômicas e outras espécies hospedeiras.
Devido às limitações inerentes ao número de amostras que podem ser recolhidos e armazenados a partir de um determinado pernoY participante, este protocolo foi concebido para extrair o ADN, ARN, e potencialmente ainda proteína a partir de uma única mecha com um fenol-clorofórmio com esferas batendo-5,6 método adaptado. A combinação de ruptura física das paredes das células bacterianas com talão-batimento e perturbações química com detergentes permite rápida de lise de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, e ácido-resistentes, sem etapas adicionais de digestão enzimática. Para obter o RNA de alta qualidade, é recomendado o uso de compressas secas que foram mantidas a ou abaixo de 4 ° C imediatamente após a colheita e durante o transporte para o laboratório (se aplicável), e armazenada a longo prazo a -80 ° C.
Para determinar o microbioma bacteriana dentro de uma dada amostra, este procedimento utiliza 16S rRNA sequenciamento amplicon gene, que é atualmente o meio mais rentáveis para atribuir de forma abrangente taxonomia bacteriana e realizar quantificação relativa. Os métodos alternativos incluem alvo qPCR 7, microarr personalizadoays 8, e de todo o sequenciamento do genoma 9. O gene 16S rRNA contém nove regiões hipervariáveis, e não há consenso sobre a região V ideal para sequenciar para estudos microbioma vaginais. Aqui usamos o conjunto de primers 515F / 806R e construir sobre o gasoduto projetado pelo Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al 's. 515F / 806R conjunto de iniciadores permite a multiplexação de centenas de amostras em uma única sequenciamento de execução devido à disponibilidade de milhares de primers barcoded validados e compatibilidade com plataformas de sequenciamento Illumina. Ao contrário de 27F / 338R cartilha do Projeto Microbioma Humano ajuste 13, 515F / 806R também amplifica efetivamente Bifidobacteriaceae e capta com precisão, assim, Gardnerella vaginalis, um membro importante da comunidade microbiana vaginal em algumas mulheres. Em alternativa, um par de iniciadores de 338F / 806R tem sido utilizado com sucesso para pyrosequencing de amostras vaginais 14 e um par de iniciadores de 515F / 926R tem recently se tornam disponíveis para a próxima geração de sequenciamento 12.
Finalmente, este protocolo fornece instruções básicas para realizar 16S análise amplicon utilizando os Insights quantitativos em Ecologia Microbiana (QIIME) Pacote de software 15. A implementação bem sucedida dos comandos QIIME descritos aqui gera uma tabela contendo abundâncias taxonômicos de bactérias para cada amostra. Muitos passos adicionais de controlo de qualidade, os métodos de classificação taxonómica, e passos de análise podem ser incorporadas na análise, tal como descrito em detalhe no site da QIIME (http://qiime.org/index.html). Se a análise será realizada em um computador Apple, o pacote MacQIIME 16 oferece fácil instalação de QIIME e suas dependências. Pacotes de software alternativos para análise de sequência do gene 16S rRNA incluem Mothur 17 e UPARSE 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um protocolo para a identificação e caracterização de abundâncias bacterianas relativo dentro de um esfregaço vaginal humana. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros tipos de amostras, tais como fezes e suabes de outros locais do corpo, e para amostras coletadas a partir de uma ampla variedade de fontes. A extracção de ácido nucleico de cordão-batendo numa solução tamponada de fenol e clorofórmio permite o isolamento de ambos o ADN e ARN, que é particularmente importante quando se trabalha com amostras preciosas recolhidos por meio de estudos clínicos. O DNA bacteriano isolado é excelente para a identificação taxonômica bacteriana e montagem genômica, enquanto a recolha simultânea de RNA fornece a oportunidade de determinar bacteriana funcional, anfitrião, e as contribuições virais através de RNA-seq. O protocolo descrito utiliza um conjunto validado de uma etapa de primer que foi implantado com sucesso em uma ampla gama de tipos de amostras, incluindo humano, canino, e amostras ambientais 10 </sup>. A disponibilidade de milhares de primers com código de barras permite multiplexação das amostras e uma enorme poupança nos custos de seqüenciamento. O custo total (incluindo todos os reagentes, uma única corrida de seqüenciamento e primers, mas não equipamentos) é de cerca de US $ 20 por amostra quando 200 amostras são multiplexados. Além disso, não é muito elevada reprodutibilidade quando vários cotonetes a partir do mesmo local de amostra são processados independentemente ao longo de todo o oleoduto. No geral, o protocolo é custo eficiente, flexível, confiável e repetível.
A parte de extração de ácidos nucléicos deste protocolo é limitado pelas precauções de segurança necessárias quando se trabalha com fenol e clorofórmio, e os desafios da automatização do gasoduto para uma alta taxa de transferência, formato de placa de 96 poços. Adicionalmente, o batimento vigorosa grânulo usado para as tesouras lise mecânica do ADN bacteriano de cerca de 6 fragmentos de quilobases; se fragmentos de ADN mais longos são necessários para aplicações a jusante, a duração do talão batendo should ser encurtado. As limitações da porção de identificação bacteriana deste protocolo são inerentes a qualquer método que se baseia em seqüenciamento do gene 16S rRNA. 16S rRNA seqüenciamento é ideais para a identificação de bactérias para o nível de género e até mesmo espécies, mas raramente fornece a identificação do nível de tensão. Enquanto a região variável da V4 do gene 16S rRNA proporciona a discriminação entre a maioria das robusta 11 espécies bacterianas, métodos computacionais adicionais, tais como Oligotyping 31 pode precisar de ser usada para identificar com precisão certas espécies, tais como Lactobacillus crispatus. Finalmente, a informação sobre as capacidades funcionais bacterianos precisa dentro de uma determinada amostra não pode ser determinada por sequenciação de 16S rRNA gene sozinho, embora este protocolo permite a extracção do DNA do genoma e ARN que podem ser usadas para esta finalidade.
O passo mais fundamental para garantir o sucesso com este protocolo está tomando grande cuidado para evitar contaminação during de recolha de amostras, a extracção de ácido nucleico, e a amplificação por PCR. Assegurar a esterilidade no momento da coleta da amostra através do uso de luvas limpas e usar compressas estéreis, tubos e tesoura. Para avaliar se há contaminação dos materiais de coleta, coletar swabs de controlo negativo, colocando compressas não utilizadas adicionais diretamente em tubos de transporte no momento da amostragem. No laboratório, executar todas as etapas de pré-amplificação em uma capa esterilizado contendo suprimentos única descontaminadas e usando apenas a nota molecular, reagentes isentos de ADN. Durante a extração de ácido nucleico, evitar a contaminação cruzada, usando novas pinças esterilizadas e luvas frescas com cada amostra, e mantendo todos os tubos fechados a menos em uso. Processamento swabs não utilizados em paralelo garante a esterilidade tanto da coleta de amostras e extração de ácido nucleico; os cotonetes não utilizados não devem produzir um pelete após precipitação isopropanol e lavagem de etanol. Se um pellet for exibido, execute a amplificação do gene 16S rRNA para determinar uma possível fonte dea contaminação (por exemplo, a presença de Streptococcus ou Staphylococcus iria indicar a contaminação da pele). Além disso, efectuar as amplificações de PCR de controlo sem reacções modelo em paralelo para assegurar que os reagentes e as reacções de PCR não ter sido contaminadas. Se aparecer uma faixa em um controle nenhum modelo, descarte os reagentes e repetir a amplificação com reagentes frescos. Tomando essas precauções irá garantir sequenciamento sucesso das bactérias de interesse.
O passo de amplificação por PCR tende a necessitar de mais solução de problemas. Amplificando em conjuntos de doze exemplos proporciona um equilíbrio entre eficiência e consistência. A completa ausência de bandas em todas as amostras de um dado conjunto de amplificação indica uma falha sistemática, por exemplo, esquecendo-se adicionar um reagente ou incorrectamente programação do termociclador. A ausência de uma banda de algumas amostras é geralmente devido a erro humano, e as amplificações deve ser re-run com o mesmo emparelhamento de amostra e iniciador inverso. No caso da ausência de uma banda contínua, a amostra pode ser re-amplificada utilizando um iniciador reverso com um código de barras diferente. falhas repetidos de amplificação com múltiplos iniciadores inversos podem indicar um inibidor presente na amostra. Nesse caso, a limpeza do ADN com uma coluna, muitas vezes, remover inibidores sem alterar significativamente as abundâncias relativas bacterianas. Se várias bandas resultar após a amplificação, re-amplificar a amostra com um código de barras iniciador inverso diferente.
Além de evitar a contaminação do ambiente e assegurar a amplificação de um único produto específico, a sequenciação de sucesso depende de cuidado quando se prepara a biblioteca piscina. O objectivo é combinar quantidades equimolares de fragmentos amplificados de cada amostra para assegurar aproximadamente o mesmo número de sequenciação leituras por amostra. Se as concentrações de ácido nucleico antes da amplificação são comparáveis, a simples adição de volumes iguais de cada saamplicons de mple é suficiente ao criar o pool de biblioteca. No entanto, se as concentrações de ácido nucleico são muito diferentes e adicionado em volume igual, a amostra com a baixa concentração de ácido nucleico irá estar mal representados com um número baixo de leituras. Nesta caso, é possível adicionar um volume maior de produtos de amplificação a partir da baixa concentração de amostra com base na intensidade relativa de a banda de gel. Em alternativa, é possível remover mais rigorosamente iniciadores a partir dos fragmentos amplificados individuais, quantificar a concentração amplicão de amostra individual, utilizando um kit de ADNcd quantificação fluorométrico, e precisamente combinam-se quantidades equimolares de cada amostra.
Uma vez que uma piscina amplicon bem equilibrada é gerado, ele torna-se crítica para medir cuidadosamente a concentração da piscina. diluição cuidadosa subseqüente e spike-in com phix para aumentar a complexidade de leitura é fundamental para alcançar os melhores resultados de sequenciamento. sequenciadores de alto rendimento que usam sequencing por síntese são muito sensíveis à densidade do aglomerado na célula de fluxo. Carregando uma piscina biblioteca que é muito concentrada resultará em Overclustering, com menor pontuação de qualidade, saída de dados mais baixa, e demultiplexing imprecisa 32. Carregando um pool da biblioteca que é demasiado diluída também vai resultar na saída de dados de baixo. Cuidadosamente quantificar a piscina biblioteca antes da sequenciação irá garantir os melhores resultados.
Seqüência do gene 16rRNA fornece uma avaliação abrangente das bactérias presentes dentro de uma dada amostra e é um primeiro passo absolutamente crítico na geração de hipóteses. A presença de um rico conjunto de metadados ainda permite que o pesquisador para testar associações entre espécies bacterianas específicas e fatores biológicos importantes. Além disso, a mesma informação 16S pode ser usada para inferir as funções bacterianas utilizando com ferramentas tais como PICRUSt 33. O objetivo final é usar 16S caracterização para identificar novos associações que podem serainda mais testado e validado em sistemas modelo, acrescentando à nossa crescente compreensão do impacto do microbioma bacteriana sobre a saúde humana e doenças.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós gostaríamos de agradecer a Elizabeth Byrne, David Gootenberg, e Christina Gosmann para feedback crítico sobre o protocolo; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco, e Jason Norman para orientação preparação de amostras e demonstrações; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgin, e Bruce Walker para o conselho de protocolo e discussões frutíferas; e Jessica Hoisington-Lopez para seqüenciamento apoio. Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates e o NIAID (1R01AI111918). DSK recebeu apoio adicional do Fundo Burroughs Wellcome. MNA foi apoiado pelo número prêmio T32GM007753 do NIGMS, eo Paul e Daisy Soros Fellowship. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais da NIGMS ou do NIH.
Materials
| Equipment: | |||
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
| Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
| Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
| MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
| ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
| SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
| 2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
| UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
| 1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
| 0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
| Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
| UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
| 2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
| Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
| Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
| 1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
| PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
| 0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
| Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
| 50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
| DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| 6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
| 50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
| AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
| UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers: | |||
| 515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
| Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
| Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |
References
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