הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג'ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי מאוניברסיטת קוואזולו נטאל (דרבן, דרום אפריקה) ו הדירקטוריון סקירה מוסדיים החולים הכללי של מסצ'וסטס (2012P001812 / MGH; בוסטון, MA). 1. הפקת חומצות גרעין סך מטליות הצרויקו הערה: בצע עקירות חומצות גרעין בסטים של 16 דגימות או פחות. הפרוטוקול כפי שנכתב להלן מניח דגימות מעובדי סטים של 12. אם ביצוע סבבים רבים של עקירות, סדר למספר את קבוצות החילוץ ולהקליט כל מספר אצווה החילוץ של מדגם וכן מידע מדגם אחר (כולל metadata כגון מספר תעודת זהות של המשתתף, גיל , תאריך / שעה של אוסף ספוגי, סוג מניעה הורמונליים, תוצאות בדיקות זיהום המועברות במגע מיני, וכו ') בלוח 1. הכנת ריאגנטים במנדף <li> הכן חיץ המורכב נתרן כלורי 200 מ"מ (NaCl) 200 מ"מ טריס, ו -20 מ"מ חומצה edetic (EDTA) ב 100 מ"ל מים nuclease חינם. מסנן לעקר את הפתרון על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. צ'יל aliquot של 10 מ"ל של חיץ על קרח רטוב. התאם את ה- pH של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (רש"ת) (25: 24: 1) ל -7.9 pH על ידי הוספת 65 μl של חיץ אלקליין טריס לכל 1 מ"ל פנול, לוחץ את התערובת במשך 2 דקות, ומאפשר שני שלבים נפרד באופן טבעי או על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 5 דקות ב RT. זהירות: פנול הוא רעיל בבליעה, אם נשאף, או במגע עם עור ועיניים. לא לנשום אדי. יש להשתמש בכפפות אטומות, משקפי מגן עם מגן בצד, וחלוק מעבדה. מסנן לעקר 25 מ"ל של סולפט dodecyl נתרן 20% (SDS) דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. הפוך 5 מ"ל aliquots של SDS מעוקרים. צ'יל aliquot 10 מ"ל של isopropanol ב -20 ° C. להכין צינור מכות חרוז לכל זהwab להיות מעובד על ידי שקילה מתוך 0.3 גרם של חרוזי זכוכית לתוך צינור מ"ל 2 סטרילי כי הוא מתאים מקצף חרוז. השג דגימות באמצעות דגימת ectocervix בספוגית סופגת סטרילית. מיד לאחר איסוף, למקם את ספוגית לתוך cryovial ריק וסטרילי, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 4 שעות במהלך ההובלה למעבדה, ולאחסן במשך מספר חודשים ב -80 ° C. מעביר את המטליות (המוקפת צינורות בודדים) להיות מעובד לקרח רטוב. הכן את ארון הבטיחות הביולוגי (BSC). השתמש BSC עם "אצבעון" מחובר פליטת הבניין על מנת להבטיח הסרה תקינה של כימיקלים נדיפים. הסר את כל החומרים ממכסת המנוע. נקו את כל המשטחים של מכסה המנוע עם אקונומיקה, ואחריו decontaminant שמסיר RNases, DNases, ו- DNA ממשטחים. הפריטים יש לנקות את כל הבאים הביאו בתוך הברדס באמצעות אקונומיקה ואחריו decontaminant חומצות גרעין, כוללים כפפות. השתמש ריאגנטים RNase / DNase ללא טריים, כגון pטיפים ipette, בכל הזדמנות אפשרית. קלטת שקית Biohazard כימי מעוקרת לחלק האחורי של מכסה המנוע. כל פסולת היבשה המכילה פנול או כלורופורם צריכה להיות ממוקמת בתוך שקית זו לסילוק נאות. מניחים בקבוק סטרילי לתוך מכסה המנוע כדי לאסוף פסולת נוזלית המכילה פנול או כלורופורם. חילוץ פנולים, כלורופורם. ב למכסה המנוע, צינור אחד מכות חרוז, להוסיף 500 μl של חיץ (משלב 1.1.1), 210 μl של סולפט dodecyl נתרן 20%, ו -500 μl של פנול: כלורופורם: רשות העתיקות (25: 24: 1, pH 7.9 ). מעביר את הספוגית מבקבוקון התחבורה לתוך הצינור הפועם חרוז באמצעות זוג חדש של מלקחיים סטריליות. ביסודיות לשפשף את הראש מקלון נגד הקירות הפנימיים של הצינור מכות חרוז עבור 30 שניות לפחות. Re-כובע המדגם בסיום. אם ביצוע עקירות מן המטליות מרובות, לשנות כפפות בין כל דגימה. צ'יל המדגם על קרח במשך לפחות 10 דקות. הסר את הספוגית מןחרוז פועם צינור ידי החזקת הידית הספוגית עם פינצטה סטרילית תוך כדי הלחיצה על הראש הספוגי בקיר הצינור הפנימי באמצעות קצה P200 נקי. מחק את המטליות בשקית הפסולת כימי היבשה. הערה: פעולת "המגב" (לחיצה על הראש הספוגי) תשחרר נוזלי מהמקלון סופג ולהגדיל את התאוששות חומצות הגרעין. מניחים את הצינור מכות חרוז נכנס למחבט חרוז homogenize עבור 2 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה הצינור הפועם חרוז 3 דקות ב 6000 XG ו -4 ° C עד הגלולה פסולה ולהפריד את השלבים מימיית פנול. מעביר את השלב המימי (~ 500 – 600 μl) לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי. הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: רשות העתיקות. מערבבים על ידי היפוך vortexing קצר. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס. מעביר את השלב המימי כדי צינור 1.5 מיליליטר סטרילית חדש. להיות שמרני לא להעביר חומר משכבת ​​הביניים או פנול שבבסיסשלב. הערת היקף השלב המימי העבירה. שמור את השלב פנול לבידוד חלבון בעתיד. להוסיף 0.8 נפח isopropanol ו -0.1 היקף נתרן אצטט 3M (pH 5.5). מערבבים היטב על ידי היפוך vortexing בקצרה. לזרז את חומצות גרעין על ידי מצמרר את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 2 (עד O / N). ממטרים ואתנול Isopropanol לשטוף צנטריפוגה הצינור במשך 30 דקות ב כ XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס. בזהירות להשתמש פיפטה להסיר את supernatant, עוזב את הגלולה ללא פגע. הוסף 500 μl של 100% אתנול. לעקור את הגלולה עם vortexing או pipetting העדינים בלי לגעת הגלולה. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס. בזהירות להתעלמות supernatant אתנול. השתמש pipet P10 להסיר אתנול ככל האפשר מבלי להפריע גלולה. האוויר יבש גלולה ב RT במשך 15 דקות. Resuspend גלולה ב 20 μl מבנים תת-קרקעltra-טהור 0.1x חיץ טריס-EDTA. אפשר המדגם לצנן על קרח למשך 10 דקות ו פיפטה מספר פעמים כדי להבטיח resuspension מלא. אם הגלולה אינה מתמוססת, להעביר את הצינור כדי לחסום חום C 40 ° עד 10 דקות כדי לסייע פירוק. למדוד את ריכוז חומצות גרעין באמצעות ספקטרופוטומטר 19. אם תרצה, DNA נפרד מ- RNA באמצעות ערכת ניקוי טור, בעקבות של פרוטוקול היצרן 20. אחסן את חומצות גרעין ב -80 ° C או להמשיך. 2. הגברת PCR של אזור 16S rRNA ג'ין V4 Hypervariable הערה: בצע את הגברת PCR בסטים של 12 דגימות או פחות כדי להקטין את הסיכון של זיהום וטעויות אנושות. אם ביצוע סבבים רבים של הגברה, סדר למספר את אצוות ההגברה ולהקליט כל המספר יצווה הגברה של מדגם בטבלה 1. להכנת מי שתייהf ריאגנטים ברדס PCR הוסף את המידע להגדיר הגברת PCR טבלת 1, אשר ישמש כבסיס של קובץ המיפוי בשלב ניתוח רצף. הסר את כל החומרים מתוך מכסה מנוע PCR ו לנקות את המשטחים הפנימיים ביסודיות עם אקונומיקה ואחריו decontaminant מסיר RNases, DNases, ו- DNA. הקפד לטהר כל מגיב פיסת הציוד (למשל, טפטפות) לפני הצבת בתוך הכובע. יש להשתמש בכפפות טריות לנקות עם decontaminant חומצות גרעין לפני העבודה בתוך הכובע. במידת הצורך, לדלל את תבנית חומצות גרעין כדי 50 – 100 ng / μl באמצעות מים DNA חופשי nuclease חינם. aliquots הפשרה של באיכות הגבוהה 5x (HF) החיץ, dNTPs, ו פריימרים בשכונת PCR הנקיה. בעדינות מערבולת ו צנטריפוגות כל פתרונות לאחר ההפשרה. כדי למזער להקפיא להפשיר מחזורים ואת הסיכון לזיהום המניות, להכין aliquots של חיץ 5x HF, dNTPs, ו פריימרים. מקוםbenchtop הנקי מתל מצנן צינורות microcentrifuge צידנית צלחת PCR לתוך מכסה המנוע. לקבלת תגובת PCR, להכין מיקס מאסטר על ידי שילוב 15.5 μl של מים טהורים, 5 μl של חיץ 5x HF, 0.5 μl של dNTPs, 0.5 μl של פריימר 515F קדימה, 0.75 μl של 3% DMSO, ו 0.25 μl של פולימראז עבור כל תגובה. הרכב את כל מרכיבי התגובה בחדר הקירור ולהוסיף פולימראז האחרון. לערבב היטב על ידי pipetting. הוסף שתי דגימות נוספות כדי לספור תגובה בעת הכנת מיקס מאסטר, לתת דין וחשבון על שגיאת pipetting. הגדרת תגובת PCR: הערה: בצע amplifications בשלושה עותקים, כלומר כל דגימה מוגברת בשלוש תגובות μl 25 נפרדות. הפעל שליטת מים ללא תבנית עם כל זוג פריימר. לעבוד מהר אבל בזהירות, הימנעות כניסתה של כל זיהום. לייבל רצועת 8-גם עם כובעי פרט ומקום לתוך צידנית PCR. פיפטה 90 μl של תמהיל מאסטר לתוך הראשוןטוֹב. הוסף 2 μl של פריימר הפוכה (קובץ משלימה 1). הקפד לציין את הברקוד פריימר הפוך בזהירות בשימוש עם כל דגימה בטבלה 1. מערבבים היטב ומעבירים 23 μl של מיקס מאסטר הבאר הרביעי (הבקרה ללא תבנית). הוסף 2 μl של מים אל הבאר הרביעית. הוסף 6 μl של המדגם המתאים הבאר הראשונה. מערבבים היטב ומעבירים 25 μl לבאר השני. טיפי שינוי ולהעביר עוד 25 μl מהבאר הראשונה לשלישי היטב. בתוקף מכסה כל טוב, כדי לוודא שלא לגעת בפנים של בארות או כובע בתהליך. חזור על הפעולה עבור כל דגימה. בצע הגברת PCR העברת צינורות הרצועה על thermocycler ולהפעיל את התכנית הבאה: 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 מחזורים של 10 שניות ב 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב 57 מעלות צלזיוס ו -12 שניות על 72 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות להחזיק ב 72 מעלות צלזיוס, אחיזה סופיתt 4 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים הבאים על ספסל מעבדה נקי. במהירות לסובב את הצינורות כדי לאסוף נוזל מהקירות. שלב תגובות PCR בשלושה עותקים מכל מדגם, בהיקף כולל של 75 μl, לתוך צינור שכותרתו סטרילי. כמו כן להעביר 25 μl של כל פקד ללא תבנית לתוך צינור סטרילי נפרד. אין לשלב amplicons ממדגמים שונים עדיין. אימות של הגברת PCR המוצלחת של דגימות על ידי ג'ל אלקטרופורזה. הכן ג'ל 1.5% agarose (1.5 גרם אבקת agarose ב 100 מ"ל של חיץ 1x טה) עם בארות מספיק כדי להחזיק בכל amplicon, בקרת מים, סולם 21. בעוד מתקשה ג'ל (כ -30 דקות), להכין את המדגם עבור אלקטרופורזה: מוסיפים 1 μl של צבע טעינת 6x לצינור חדש, שכותרתו. כדי צינור מכן, להוסיף 5 μl של amplicon ומערבבים ידי pipetting. כאשר הג'ל קבעה, מסלק את היערה, מניחים את הג'ל במיכל אלקטרופורזה, ולמלא את המיכל עם חיץ 1x טה. </li> כדי הבאר הראשונה, להוסיף 5 μl של סולם ה- DNA. טען 5 μl על amplicon מדגם למשנהו היטב. טען 5 μl של amplicon ללא תבנית באר נפרד. המשך לפי הצורך עבור כל דגימה. כאשר כל הדגימות הוטענו, החלק את המכסה טנק במקום ולהדליק את מקור הכוח 120 V. אפשר ג'ל לרוץ 30 – 60 דקות. הצג את הג'ל תחת אור UV. אמת הגברה מוצלחת של כל דגימה על ידי וציין להקה חזקה אחת כ -380 נ"ב. אם יש להקה כפולה, מחדש להגביר מדגם עם ברקוד הפוכה שונה (שלב 2.3). אם אין להקה בכלל, מחדש להגביר במדגם או באמצעות אותו ברקוד הפוכה או ברקוד ההפוכה חדשה (שלב 2.3). אם מחדש ההגברה אינה מצליחה, מעכבי PCR רשאיים להיות נוכחים במדגם, ובמקרה זה, לבצע ניקוי DNA מבוסס עמודה כדי להסיר מעכבי PCR. הערה: הגברה מוצלחת לא יכולה להיות אפשרית אם ריכוז ה- DNA חיידקים אומדגם iginal אינו מספיק (<5 ng / μl). בדוק את חוסר זיהום מגיב באמצעות ציון בהיעדר להקה בבקרה ללא תבנית. אחסן את amplicon 70 μl של הנותרים ב -20 ° C. מחק את הנותרים 20 μl של שליטה ללא תבנית, בהנחה שזה לא הניב הלהקה. 3. איגום ספריית רצף תפוקה גבוהה צור ברכת amplicon ידי שילוב נפח שווה (2 – 5 μl) של כל amplicon לתוך צינור סטרילי יחיד. אם הלהקה ממדגם נראית חלשה במיוחד, להוסיף כפול ביחס הנפח לשאר הדגימות. הסר את פריימרים PCR ממאגר amplicon באמצעות ערכת ה- PCR ניקוי, בעקבות הוראות היצרן 22. בצע את לנקות עם מספר עמודות אם נפח ברכת amplicon הוא מעל 100 μl. הערה: כל טור בעל קיבולת 100 μl. אחסן את הספרייה ב -20 & #176; C או להמשיך לשלב הבא. במידה והדבר אפשרי, לשלב את בריכות amplicon ללא פריימר כדי ליצור את הספרייה הסופית. קבע את ריכוז DNA של הספרייה באמצעות ספקטרופוטומטר או מערכת fluorometric 23. יחס 260/280 בין 1.8 – 2.0 הוא מעיד על דנ"א טהור. לדלל את הספרייה עד 20 ננומטר. אשר את האיכות של הספרייה על ידי הדמית להקה אחת כ -400 נ"ב באמצעות מכשיר אלקטרופורזה. אשר את הריכוז של הספרייה באמצעות מערכת fluorometric 23. בצע דילול 1:10 סופי במים לדלל לספרייה 2 ננומטר. לאחר מכן, לאחסן את הספרייה ב 20 ° C ללא הגבלת זמן. שלח aliquot של הספרייה הסופית עם פריימרים רצף שלושה נדרש (קרא 1, קרא 2, ואינדקס; ראו לוחות חומרים / ציוד) כדי להיות רצף על ברצף Illumina. אם פחות מ -300 דגימות כבר מרובבים על רצף, השתמש בטווח אחת-סוף -300 נ"ב ועם מדד 12 נ"ב לקרוא oנה MiSeq, עם ריכוז ספרייה סופי 5 בערב, ספייק-ב PhiX מפוגל 10%. עיין חומרים המשלימים של Caporaso et al. IsMe J, 2012 10 לקבלת הוראות רצף מפורטות. ניתוח רצף 4. הערה: מתואר כאן היא צינור בסיסי לניתוח רצף באמצעות חבילת תוכנת 1.8.0 QIIME. לשם הפשטות, את הפקודות הניתנים להניח כי קובץ מיפוי נקרא mapping.txt, מדד 12 נ"ב לקרוא קובץ נקרא index.fastq, ואת רצף -300 נ"ב לקרוא קובץ נקרא sequences.fastq. התקן QIIME או MacQIIME 16 וכן היכרות עם היסודות של UNIX כדי לבצע פקודות אלה. קראו את המדריך השלם QIIME ב: השלם את קובץ מיפוי לצורך הניסוי (טבלה 1). לכלול מטה האפשר. שים לב אילו דגימות הופקו או מוגברות באותו יצווה, כדי לברר אם קיימים תופעות יצוו. <li> שמור את קובץ המיפוי כקובץ טקסט, למשל, mapping.txt. אמת את העיצוב של קובץ מיפוי על ידי הפעלת הפקודה הבאה: validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o mapping_output הערה: פקודה זו משתמשת תסריט QIIME "validate_mapping_file.py" המובנה שגורם תיקייה חדשה, בשם "mapping_output", המכיל קובץ .html המציין את שגיאות קובץ מיפוי, אם בכלל. בדוק את איכות הרצף קורא באמצעות איכות נתוני רצף תפוקה גבוהה בדיקת תכנית, כגון FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). איור 5 מדגים את רצף לכל בסיס האיכות כי ניתן לצפות מן ריצה מוצלחת. הערה: ברצף מקצה לכל בסיס נוקלאוטיד ציון באיכות Phred, אשר תואם ההסתברות כי הבסיס כבר נקרא בטעות. ציון איכות Phred של 10 מצביע על כך שיש סיכוי של 10% כי נוקליאוטידים כבר שגוי להקצותed, 20 מצביע על סיכוי של 1%, 30 מצביעים על סיכוי 0.1%, ו -40 (הציון הגבוה ביותר האפשרי) מצביע על סיכוי של 0.01% 24. באמצעות קובץ מיפוי כמפתח, demultiplex, איכות לסנן את הנתונים רצף, ולשמור את התוצאות לתיקייה (במקרה הזה, הנקרא "sl_out") על ידי הפעלת פקודה זו 25: split_libraries_fastq.py –rev_comp_mapping_barcodes -i sequences.fastq -o sl_out / -b index.fastq -m mapping.txt -q 29 הערה: דגל q מציין את ציון Phred איכות מקובלת המרבית, למשל, "-q 29" מסננים רצפים עם ציוני Phred מתחת ל -30, כדי להבטיח דיוק 99.9% מהפניות הבסיס. שימוש ביחידת טקסונומיות מבצעית Greengenes 16S הנתונים להפניה (OTU) 26 (http://qiime.org/home_static/dataFiles.html), לבצע OTU פתוח הפניה לקטוף שהרצתו בפקודה זו 27: pick_open_reference_otus.py -i sl_out / seqs. Fna -r 97_otus.fasta -o ucrss / -s 0.1 הערה: דגל -s מצייןאת החלק היחסי של רצפים שלא הצליח ליישר נתונים להפניה כי ייכללו התקבצות דה נובו. "-s 0.1" כולל 10% של רצפים נכשל התקבצות דה נובו. השתמש דגל -a כדי למקבל התהליך לקטוף OTU ולהפחית את זמן עיבוד מימים לשעות אם ליבות מרובות זמינות. צור טבלה שפע טקסונומיות ידידותי למשתמש על ידי מיזוג OTUs ברמת המין שהרצתו בפקודה זו 28: summarize_taxa.py -i ucress / otu_table_mc2.biom -o summarized_otuSpecies / -L 7 הערה: הטבלה וכתוצאה מכך ניתן לצפות בקלות בכל תוכנת גיליון אלקטרוני. שים לב רצף 16S rRNA אינו מהימן לספק רזולוצית מיני רמה. קבע את הגיוון האקולוגי בתוך כל דגימה באמצעות חישוב מדדי המגוון אלפא כמה עם alpha_diversity.py סקריפט QIIME. לאחר מכן, לקבוע את המגוון בין זוגות של דגימות בעזרת beta_diversity.py סקריפט QIIME. Visualize הנתונים, למשל, באמצעות קרן 29 קיסר קואורדינטות עלילה או מפת חום. לבצע השוואות סטטיסטיות רשמיות של קטגוריות קובץ מיפוי, למשל, עם תסריט compare_catagories.py של QIIME 30.