Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

Çalışma protokolü tarafından onaylanmış ve KwaZulu-Natal Üniversitesi Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi (Durban, Güney Afrika) ve Massachusetts General Hospital Kurumsal Değerlendirme Kurulu (2012P001812 / MGH; Boston, MA) yönergeleri takip etti. Servikovaginal Swablar Toplamı Nükleik Asit 1. Ekstraksiyon Not: 16 numune veya daha az setlerinde nükleik asit ekstraksiyon gerçekleştirin. Aşağıda yazılı olarak protokol (örneğin katılımcının kimlik numarası, yaş gibi meta verileri ekstraksiyon birden mermi performans, seri çıkarma toplu numara ve her numunenin çıkarma parti numarası yanı sıra diğer örnek bilgileri kayıt yaparsanız numuneler 12. setler halinde işlenir varsayar Tablo 1'de çubukla koleksiyonu, hormonal kontraseptif tipi, cinsel yolla bulaşan enfeksiyon testi sonuçlarına, vb) tarih / zaman. reaktifler ve davlumbaz hazırlanması <li> 200 mM sodyum klorür (NaCl), 200 mM Tris, ve nükleaz içermeyen su, 100 ml 20 mM edetik asit (EDTA) içeren bir tampon hazırlayın. -Filtre sterilize 0.22 mikron filtre geçirilerek çözüm. ıslak buz üzerinde 10 ml tampon bir kısım Chill. (1: 25: 24), pH 7.9, iki faz, 1 mL fenol Tris alkalin tampon 65 ul ekleyerek 2 dakika karışım çalkalanarak ve izin vererek: kloroform: izoamil alkol (IAA) fenol pH ayarlama doğal ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile bölüştürüldü. Dikkat: Solunduğunda, yutulduğunda ya da cilde ve göze temas ederse Fenol zehirlidir. Dumanı içinize çekmeyin. koruyucu eldiven, yan siperleri olan güvenlik gözlükleri ve bir laboratuvar ceket giyin. -Filtre sterilize 0.22 um filtre içinden% 20 sodyum dodesil sülfat (SDS), 25 ml. sterilize SDS 5 ml alikotları yapın. -20 ° C'de izopropanol 10 ml'lik bir şişe Chill. Her s için bir boncuk dayak tüp hazırlayınwab kordon mikser için uygun olan bir 2 ml'lik steril bir tüpe cam boncuklar 0.3 g tartılması tarafından işlenecek. Steril bir emici bez ile ektoservikste örnekleyerek bezlerden elde edin. Toplandıktan hemen sonra, laboratuara nakil esnasında 1 saat ila 4, 4 ° C'de boş ve steril cryovial, deposuna çubukla yerleştirin ve -80 ° C'de birkaç ay depolanabilir. (Bireysel borular içinde yer alan) bezlerden transfer ıslak buz işlenecek. biyolojik güvenlik kabini (BSC) hazırlayın. Bir "yüksük" uçucu kimyasalların doğru kaldırılmasını sağlamak için bina egzoz bağlı olan bir BSC kullanın. kaput tüm malzemelerini çıkarın. yüzeylerden RNases, DNases ve DNA kaldıran bir temizleyici ardından çamaşır suyu ile kaput, tüm yüzeylerini temizleyin. Temiz sonraki tüm öğeleri eldivenler dahil bir nükleik asit temizleyici, ardından çamaşır suyu kullanarak kaputun içine getirdi. p gibi taze RNaz / DNaz ücretsiz reaktifler kullanınipette ipuçları, mümkünse. kaput arka steril bir kimyasal biyolojik tehlike çanta bantlayın. fenol veya kloroform içeren tüm kuru atıklar uygun bertaraf bu torbaya konulmalıdır. fenol veya kloroform içeren sıvı atıkları toplamak için kaputun içine steril bir şişe yerleştirin. Fenol-kloroform ekstraksiyonu. kaput, her bir tane, dayak tüp, tampon 500 ul,% 20 sodyum dodesil sülfat 210 ul ve fenol 500 ul (aşama 1.1.1): kloroform: IAA (25: 24: 1, pH 7.9 ). Steril forseps yeni bir çift kullanarak boncuk atan tüpe taşıma flakonundan çubukla aktarın. Iyice en az 30 saniye boyunca boncuk atan tüpün iç duvarlarına karşı sürüntü kafasını ovmak. Yeniden kap örneği yapılır. Birden bezlerden gelen çekimi gerçekleştirerek, her numune arasında eldiven değiştirmek. En az 10 dakika boyunca buz üzerinde örnek Chill. Bezi çıkarınTemiz bir P200 ucunu kullanarak iç tüp duvara çubukla kafasına basarken steril cımbız ile sürüntü kolunu tutarak tüp yenerek boncuk. Kuru kimyasal atık torbasına bezlerden atın. Not: "silecek" eylem (sürüntü kafasını basarak) emici bez sıvının kurtarmak ve nükleik asit kurtarma artacaktır. Boncuk çırpıcı boncuk atan tüp yerleştirilir ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca homojenize edilmiştir. Santrifüj 6,000 xg'de 3 dakika 4 ° C kordon dayak borusu yıkıntıları pelet haline ve sulu fenol fazlar ayrıldı. steril bir 1.5 ml'lik tübe – (600 ul ~ 500) sulu faz transfer. kloroform: fenol eşit miktarda ekleme IAA. inversiyon ve kısa vorteks ile karıştırın. 16.000 x g'de 5 dakika 4 ° C'de tüp santrifüjleyin. yeni bir steril 1.5 ml'lik tübe sulu faz transfer. muhafazakar ve interfaz tabakası ya da altta yatan fenol materyal transfer değilfaz. transfer sulu fazın hacmi unutmayın. Gelecekteki protein izolasyonu için fenol aşamasını kaydedin. izopropanol, 0.8 hacim 3M sodyum asetat (pH 5.5) içinde 0.1 hacim. inversiyon ve kısaca vorteks ile iyice karıştırın. (O / N'ye kadar) en azından 2 saat boyunca -20 ° C'de tüp soğutma nükleik asit tortusunun. İzopropanol yağış ve etanol yıkama yaklaşık 16,000 x g'de ve 4 ° C'de 30 dakika süre ile boru santrifüjleyin. Dikkatle bozulmamış pelet bırakarak süpernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. % 100 etanol 500 ul ekle. pelet dokunmadan nazik bir vorteks veya pipetleme ile pelet çıkarmak. 16.000 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. Dikkatle etanol süpernatant atın. Pelet rahatsız etmeden, mümkün olduğu kadar etanolü çıkarmak için P10 pipeti kullanarak. Hava, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında pelet kurutulur. U 20 ul pelletinilökotrien antagonistlerinin saf 0.1x Tris-EDTA tamponu. tam tabanda sağlamak için numune tekrar tekrar 10 dakika ve pipet buz üzerinde soğuk izin verin. Pelet çözünmez ise, çözülmeye yardımcı olmak için, 10 dakika kadar bir 40 ° C sıcaklıkta bir blok tüp aktarın. Bir spektrofotometre 19 kullanılarak nükleik asit konsantrasyonu ölçmek. İstenirse, üreticinin protokolüne 20 aşağıdaki bir sütun temizlik kitini kullanarak RNA ayrı DNA. -80 ° C nükleik asidin saklayın veya devam edin. 16S rRNA gen V4 hiperdeğişken Bölgesi'nin 2. PCR Amplifikasyon Not: kirlenme ve insan hatası riskini en aza indirmek için 12 numune veya daha az setler halinde PCR gerçekleştirin. Amplifikasyon birden mermi gerçekleştirmek ise, seri amplifikasyon toplu numara ve Tablo 1'de her numunenin amplifikasyon parti numarası kaydedin. Preparat Oreaktifler ve PCR kaput f Dizi analizi aşamasında eşleme dosyası temel teşkil edecektir Tablo 1 PCR amplifikasyon set bilgileri ekleyin. PCR kaput tüm malzemeleri çıkarın ve RNases, DNases ve DNA kaldıran bir temizleyici ardından çamaşır suyu ile iyice iç yüzeylerini temizlemek. Kaputun koymadan önce her reaktifi ve teçhizatın (örneğin, pipetler) parçası arındırmak emin olun. önce kaputu çalışan bir nükleik asit temizleyici ile temizlenmelidir taze eldiven giyin. Gerekirse, 50, nükleik asit şablonunun seyreltik – 100 ng / DNA içermeyen ve nükleaz içermeyen su kullanılarak ul. Temiz PCR kaputun içindeki 5x yüksek sadakat (HF) tampon, dNTP, ve primer Çözülme alikotları. Yavaşça girdap ve çözdürme sonrası tüm çözümler santrifüj. 5x HF tamponu, dNTP, ve astar hacimde hazırlamak, donma-çözülme döngüleri ve stok kontaminasyon riskini en aza indirmek için. bir yerdemikrosantrifüj tüpler ve kaputun içine bir PCR plaka soğutucu temiz tezgah üzeri soğutucu raf. PCR reaksiyonu için ultra saf su 15,5 ul 5x HF tamponu 5 ul, dNTP 0.5 ul, 515F ileri primer, 0.5 ul,% 3 DMSO 0.75 ul ve polimeraz 0.25 ul birleştirilerek ana karışımı hazırlanması her reaksiyon. soğutucu tüm reaksiyon bileşenleri bir araya ve son polimeraz ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın. pipetleme hatası hesaba, ana karışımı hazırlarken reaksiyon sayısı iki ekstra örnekleri ekleyin. PCR reaksiyonu kurulumu: Not: Her numune üç ayrı 25 ul reaksiyonlarda yükseltilir, yani üç nüsha olarak yapılan genişletme gerçekleştirin. Her primer çifti ile no-şablon su kontrolü çalıştırın. Herhangi bir kontaminasyon giriş kaçınarak, hızlı ama dikkatli bir şekilde çalışın. PCR soğutucu içine bireysel kapaklar ve yeri ile bir 8-iyi şerit etiketleyin. İlk olarak ana karışımı Pipet 90 uliyi. Ters primer (İlave Dosyası 1) 2 ul ekleyin. Dikkatle Tablo 1'de her bir örnek ile birlikte kullanıldığında ters primer barkod not ettiğinizden emin olun. İyice karıştırın ve dördüncü kuyu (no-şablon kontrolü) ana karışımı 23 ul aktarın. Dördüncü kuyuya su 2 ul ekleyin. İlk kuyuya uygun numune 6 ul ekleyin. İyice karıştırın ve ikinci kuyunun 25 ul aktarın. Değişim ipuçları ve iyi üçüncü ilk kuyudan başka bir 25 ul aktarın. Sıkıca emin süreçte kuyuların içini veya kapağı dokunmamaya dikkat ederek, her yanı kap. her numune için tekrarlayın. PCR büyütmesi gerçekleştirmek bir PCR için şerit tüpleri aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırmak: 57 ° C 'de, 98 ° C'de 30 saniye, 98 ° C'de 30 saniye, 10 saniye 30 döngü, ardından bir ardından 72 ° C'de 12 sn, 10 dakika 72 ° C ve nihai tutma a at tutunT, 4 ° C. Temiz bir laboratuar tezgah üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. Hızla duvarlardan sıvıyı toplamak için tüpler dönerler. steril etiketli tüpe 75 ul toplam hacimde her bir numuneden, üçlü PCR reaksiyonları birleştirin. Ayrıca ayrı bir steril tüp içine, her hedef içermeyen kontrol 25 ul transfer. Henüz farklı örneklerden amplikonları kombine etmeyin. jel elektroforezi ile örneklerin başarılı bir PCR amplifikasyonu doğrulanması. Her bir amplikon, su kontrolü ve merdiven 21 tutmak için yeterli kuyucuklu (1x tamponu TAE, 100 ml 1.5 g agarozun toz), bir% 1.5 agaroz jel hazırlayın. Jel sertleşir (yaklaşık 30 dakika) birlikte, elektroforez için numune hazırlanması: Yeni etiketli tüpe 6x yükleme boyası 1 ul ekle. bu tüp, amplikonun 5 ul ve pipetleme karıştırın. Jel belirledi zaman, tarak kaldırmak jel elektroforez haznesine yerleştirin ve 1x TAE tamponu ile deposunu doldurun. </li> İlk kuyuya DNA merdiveninin 5 ul ekleyin. Yük de başka örnek amplikonunu 5 ul. Yük ayrı kuyucuklarına hedef içermeyen amplikon 5 ul. Her numune için gerektiği şekilde devam ediniz. Tüm örnekler yüklenmiş edildiğinde, yerinde depo kapağını kaydırın ve 120 güç kaynağı açmak V. jel 30 çalışmasına izin ver – 60 dakika. UV ışığı altında jel görüntüleyin. 380 bp etrafında tek bir güçlü bant belirterek her numunenin başarılı amplifikasyon doğrulayın. Bir çift bant varsa, farklı bir ters barkod (Adım 2.3) ile örnek yeniden yükseltmek. hiç grup varsa, aynı ters barkod veya yeni bir ters barkod (Adım 2.3) kullanılarak örnek yeniden yükseltmek. yeniden yükseltme başarısız olursa, PCR inhibitörleri, PCR inhibitörleri kaldırmak için bir kolon bazlı DNA temizleme işlemi, bu durumda numune içinde mevcut olabilir. Not: Başarılı amplifikasyon mümkün olmayabilir eğer bakteriyel DNA konsantrasyonu veyaiginal Örnek yetersiz (<5 ng / | il) 'dir. no-şablon kontrolünde bir bant yokluğu belirterek reaktif kirlenmenin olmaması doğrulayın. -20 ° C'de amplikon kalan 70 ul saklayın. Bir grup verim vermedi varsayarak, no-şablon kontrolü kalan 20 ul atın. 3. Kütüphane havuzu ve Yüksek Verimli Sıralama Tek bir steril tüp içine, her amplikon – (5 ul 2) eşit hacmi birleştirerek amplikon havuzu oluşturmak. Bir örnekten grup özellikle zayıf görünüyorsa, numunelerin geri kalan iki kez hacmini ekleyin. Imalatçının talimatlarına 22 uyarınca bir PCR temizlik seti kullanılarak amplikon havuzundan PCR primerleri çıkarın. Amplikon havuz hacmi 100 ul üzerinde ise birden çok sütun temiz-up gerçekleştirin. Not: Her bir sütun 100 ul kapasitesine sahiptir. -20 & # De kütüphane Mağaza176 C veya bir sonraki adıma geçin. Varsa, son kitaplığı oluşturmak için astar gerektirmeyen amplikon havuzları birleştirir. Bir spektrofotometre florometrik bir sistem 23 kullanılarak kütüphanenin DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 1.8 arasında 260/280 oranı – 2.0 olarak saf DNA göstergesidir. 20 nM kütüphane sulandırmak. Bir elektroforez cihazı kullanılarak 400 bp etrafında tek bir bant görselleştirerek kütüphanenin kalitesini onaylayın. Florometrik sistemi 23 kullanarak kütüphane konsantrasyonunu kontrol edin. 2 nM için kütüphane seyreltmek için su içinde son bir 1:10 seyreltme gerçekleştirin. Ardından, süresiz 20 ° C'de kütüphane saklayın. üç gerekli sıralama primerleri ile son kütüphanede bir kısım Gönder (1 Oku 2 okuyun ve İndeks; Malzemeleri / Ekipman Tabloları bakınız) Illumina dizici üzerinde sıralandı edilecek. az 300 numune sıralama için çoğullanır varsa, o bir tek uç 300 bp çalıştırmak kullanmak ve 12 bp indeksi ile okumak5 pM nihai kütüphane konsantrasyon ve% 10 denatüre phix diken-in ile na MiSeq. Ayrıntılı sıralama talimatları için Caporaso ark. ISME J 2012 10 ek malzeme bakın. 4. Sekans Analizi Not: Burada özetlenen QIIME 1.8.0 yazılım paketi kullanarak dizi analizi için temel bir boru hattıdır. Kolaylık olması açısından, verilen komutlar 12 bp dizin dosyası index.fastq denir ve 300 bp sıralama dosya sequences.fastq denir okundu, eşleme dosyası mapping.txt denir varsayalım. QIIME veya MacQIIME 16 yükleyin ve bu komutları yürütmek için UNIX temelleri ile tanıyın. En QIIME tam kılavuzunu okuyun: Deneyin (Tablo 1) eşleme dosyası tamamlayın. mümkün olduğunca meta içerir. Toplu etkileri olup olmadığını belirlemek için, numuneler çıkarılan veya aynı parti içinde güçlendirilmiş edildiği unutmayın. <li> bir metin dosyası, örneğin, mapping.txt olarak eşleme dosyası olarak kaydedin. validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o mapping_output: aşağıdaki komutu çalıştırarak eşleme dosyası biçimlendirme doğrulamak Not: Bu komut varsa, eşleme dosyası hatalarını gösteren bir .html dosyasını içeren, "mapping_output" adlı yeni bir klasör yapar yerleşik "validate_mapping_file.py" QIIME komut dosyası kullanır. Böyle FastQC olarak program kontrolü yüksek verimli bir dizi veri kalitesini kullanarak okur (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Şekil 5 baz dizisi başına kalitesini gösteren sıralama kalitesini kontrol edin Bunun iyi bir çalışma beklenebilir. Not: sequencer taban yanlışlıkla anılmış olasılığına karşılık her nükleotid baz, bir Phred kalite puanı, atar. 10 Bir Phred kalite puanı, nükleotid atamak yanlış olmuştur% 10 şans olduğunu gösterired, 20 30% 0.1 şans gösterir% 1'lik bir şans gösterir ve 40 (en yüksek skor) 0,01 şansı% 24 olduğunu gösterir. Split_libraries_fastq.py –rev_comp_mapping_barcodes -i sequences.fastq: kalite dizi verileri filtrelemek ve 25 Bu komutu yürüterek ( "sl_out" olarak adlandırılan bu durumda,) bir klasöre sonuçları kaydetmek, Demultiplex bir anahtar olarak eşleme dosyasını kullanarak -o sl_out / b index.fastq -m mapping.txt -q 29 Not: q bayrağı, örneğin maksimum kabul edilemez Phred kalite puanı gösterir, "29 -q" baz aramaların% 99.9 doğruluk sağlanması, 30'un altında Phred puanları ile herhangi bir dizileri filtreler. Greengenes 16S operasyonel taksonomik birim (OTU) referans veritabanı 26 (http://qiime.org/home_static/dataFiles.html) kullanarak, bu komutu 27 yürüterek açık referans OTU toplama gerçekleştirin: pick_open_reference_otus.py -i sl_out / seqs. fna -r 97_otus.fasta -o ucrss / -s 0.1 Not: -s bayrak gösterirDe novo kümelenme dahil edilecek referans veritabanına hizalamak için başarısız dizilerin kesir. De novo kümelenme başarısız dizilerin% 10 içeren "0,1 -s". OTU toplama işlemini parallelize ve çoklu çekirdek mevcut olup olmadığını saate gün işlem süresini azaltmak için -a bayrağını kullanın. Summarize_taxa.py -i ucress / otu_table_mc2.biom -o summarized_otuSpecies / L 7: 28 Bu komutu yürüterek tür düzeyinde Otus birleştirerek kullanıcı dostu bir taksonomik bolluk tablo oluşturun Not: Elde edilen tablo kolayca herhangi bir elektronik tablo yazılımı görülebilir. 16S rRNA dizi güvenilir tür düzeyinde çözünürlüğü sağlamaz unutmayın. QIIME komut alpha_diversity.py birkaç alfa çeşitliliği ölçümlerini hesaplayarak her bir numune içindeki ekolojik çeşitliliği belirleyin. Daha sonra, QIIME komut beta_diversity.py kullanarak numune çiftleri arasında çeşitlilik belirler. Visİmparator 29 prensibi kullanarak, örneğin verileri ualize arsa veya ısı haritası koordine eder. QIIME adlı compare_catagories.py komut 30 olan, örneğin haritalama dosya kategorisi, resmi istatistiksel karşılaştırmalar gerçekleştirin.