細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

研究プロトコールは、によって承認され、クワズール・ナタール州（ダーバン、南アフリカ）とマサチューセッツ総合病院施設内倫理委員会（2012P001812 / MGH、ボストン、MA）の大学の生物医学研究倫理委員会のガイドラインに従いました。 頸膣スワブからの全核酸の1の抽出注：16サンプルまたは少数のセットで核酸抽出を行います。以下に記述されたようなプロトコルは、参加者のID番号、年齢等のメタデータを含む（直列抽出バッチの数と各サンプルの抽​​出をバッチ番号、ならびに他のサンプルの情報を記録し、抽出の複数のラウンドを実行した場合、サンプルは、12組で処理することを前提としてい、 表1のスワブコレクション、ホルモン避妊薬の種類、性感染症検査の結果など ）の日付/時刻。 試薬およびヒュームフードの調製<li> 200mMの塩化ナトリウム（NaCl）で、200mMのトリス、およびヌクレアーゼフリー水100ml中20mMエデト酸（EDTA）からなる緩衝液を調製します。 0.22μmのフィルターを通過させることにより、溶液をフィルター滅菌します。濡れた氷の上のバッファの10ミリリットルのアリコートを冷やします。 、1ミリリットルのフェノールあたりトリスアルカリ性バッファー65μLを加え2分間振とうして、には2つのフェーズを可能にすることにより、pHを7.9にクロロホルム：イソアミルアルコール（IAA）（1：25：24）フェノールのpHを調整します室温で5分間万×gで自然にまたは遠心分離によって分離します。 注意：吸入した場合、飲み込んだ、または皮膚や目に接触した場合フェノールは有毒です。煙を吸入しないこと。不浸透性の手袋、サイドシールド付き安全メガネ、と白衣を着用してください。 フィルター滅菌0.22μmフィルターを通して20％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を25ミリリットル。滅菌SDSの5ミリリットルのアリコートを行います。 -20℃でイソプロパノール10mlのアリコートを冷やします。 各秒間ビーズビーティングチューブを準備しますWABは、ビーズビーターに適している、無菌の2mlチューブにガラスビーズを0.3gを秤量することによって処理されます。 滅菌吸収性綿棒で子宮膣部をサンプリングして綿棒を取得します。すぐに回収後、実験室に輸送中1〜4時間に4℃で空と無菌クリオバイアル、店に綿棒を置き、-80℃で数ヶ月間保管します。濡れた氷に処理される（個々のチューブ内に含まれる）綿棒を転送します。 生物学的安全キャビネット（BSC）を準備します。揮発性化学物質の適正除去を確実にするために、建物の排気と接続「シンブル」とBSCを使用してください。 フードからすべての材料を削除します。 RNアーゼ、DNアーゼ、および表面からDNAを除去する除染が続く漂白剤とフードのすべての表面をきれいにしてください。後続のすべてのアイテムをきれいに手袋などの核酸汚染除去、続いて漂白剤を使用したフードに持ち込ま。 Pなどの新鮮なRNアーゼ/​​ DNアーゼフリーの試薬を、使用してくださいipetteのヒント、可能な限り。 フードの後部に滅菌化学バイオハザードバッグをテープで固定します。フェノールやクロロホルムを含むすべての乾燥廃棄物適正処理のためにこのバッグの中に配置する必要があります。 フェノールやクロロホルムを含有する液体廃棄物を収集するためにフード内に無菌ボトルを置きます。 フェノール – クロロホルム抽出。 フードでは、各ビーズビーティングチューブのため、緩衝液500μlを追加し、20％ドデシル硫酸ナトリウムの210μlを、フェノール500μlの（ステップ1.1.1から）：クロロホルム：IAA（25：24：1、pHは7.9 ）。 滅菌ピンセットの新しいペアを使用して、ビーズビーティング管に輸送バイアルから綿棒を転送します。徹底的に少なくとも30秒間ビーズビーティング管の内部壁に対して綿棒ヘッドをこします。再キャップに実施されるサンプル。複数の綿棒からの抽出を行う場合は、各サンプル間の手袋を変更します。 少なくとも10分間氷上でサンプルを冷やします。から綿棒を削除クリーンP200チップを使用して、内部の管壁に綿棒ヘッドを押しながら滅菌ピンセットと綿棒のハンドルを保持することによって、チューブを破っビーズ。ドライ化学廃棄物バッグに綿棒を破棄します。注：「スキージ」アクション（綿棒の頭を押す）は、吸収性綿棒から液体を放出し、核酸回収が増加します。 ビーズビーターにビーズビーティングチューブを置き、4℃で2分間均質化します。 遠心分離機6000×gで、4℃で3分間ビーズビーティング管破片をペレット化し、水とフェノール相を分離します。 無菌の1.5mlチューブに – （600μL〜500）の水相を転送します。等量のフェノールを追加：クロロホルム：IAA。反転、短時間のボルテックスで混和します。 16,000×gで5分間、4℃のためのチューブを遠心。 新しい滅菌1.5mlチューブに水層を移します。保守的であると相間層または基礎となるフェノールから素材を転送しません段階。転送水相の量に注意してください。将来のタンパク質単離のためのフェノール相を保存します。 イソプロパノール0.8体積との3M酢酸ナトリウム（pH5.5）の0.1容量を追加します。反転、短時間ボルテックスで混ぜます。 （O / Nまで）、少なくとも2時間、-20℃でチューブを冷却することにより核酸を沈殿させます。 イソプロパノール沈殿及びエタノール洗浄約16,000×gで、4℃で30分間チューブを遠心。慎重に無傷のペレットを残し、上澄み液を除去するために、ピペットを使用しています。 100％エタノール500μlのを追加します。ペレットを触れることなく穏やかにボルテックスまたはピペッティングでペレットを取り除きます。 16,000×gで4℃で5分間遠心します。 慎重にエタノール上清を捨てます。ペレットを乱すことなく、できるだけ多くのエタノールを除去するために、P10ピペットを使用してください。 空気は、15分間、室温でペレットを乾燥させます。 Uの20μlにペレットを再懸濁LTRA純0.1×トリス-EDTA緩衝液。完全な再懸濁を確実にするために、サンプルを繰り返し10分とピペット氷上で冷やしできるようにします。ペレットが溶解しない場合、溶解を助けるために10分まで、40℃のヒートブロックにチューブを移します。 分光光度計19を用いて、核酸濃度を測定します。 必要であれば、製造業者のプロトコル20以下、カラムクリーンアップキットを用いてRNAとは別のDNA。 -80℃で核酸を保存したり、続行します。 16S rRNAの遺伝子V4超可変領域の2 PCR増幅注：汚染とヒューマンエラーのリスクを最小限にするために12個のサンプルまたは少数のセットでPCR増幅を行います。増幅の複数のラウンドを行う場合は、シリアル増幅バッチを数と表1に各サンプルの増幅バッチ番号を記録します。 準備O試薬およびPCRフードF 配列分析段階でマッピングファイルの基礎として役立つであろう、 表1に情報を設定し、PCR増幅を加えます。 PCRフードからすべての物質を除去し、RNアーゼ、DNアーゼ、およびDNAを除去する汚染除去に続いて、漂白剤で十分に内部表面をきれいにします。フードでそれらを配置する前に、すべての試薬 ​​や機器（ 例えば、ピペット）の一部を除染するようにしてください。フードでの作業の前に、核酸汚染除去剤で洗浄新鮮な手袋を着用してください。 必要に応じて、50に核酸鋳型を希釈 – 100 ngの/ DNAフリー、ヌクレアーゼフリー水を使用してμlの。 きれいなPCRフード内で5倍の高忠実度（HF）緩衝液、dNTP、及びプライマーの解凍アリコート。穏やかにボルテックスし、解凍後、すべてのソリューションを遠心分離機。凍結融解サイクルおよびストック汚染のリスクを最小限にするために、5×HF緩衝液、dNTP類、およびプライマーのアリコートを調製します。 プレイスAきれいなマイクロ遠心チューブ用の卓上クーラーラックおよびPCRプレートフードにクーラー。 PCR反応のために、超純水の15.5μlの、5×HFバッファーを5μl、dNTPの0.5μlを、515Fフォワードプライマーの0.5μlを、三パーセントのDMSOの0.75μL、およびのためのポリメラーゼの0.25μLを組み合わせることにより、マスターミックスを準備各反応。クーラー内のすべての反応成分を組み立て、最後のポリメラーゼを追加します。ピペッティングにより完全に混和します。マスターミックスを調製する際にピペッティング誤差を考慮して、反応数に2つの余分なサンプルを加えます。 PCR反応のセットアップ： 注：各サンプルは3つの別々の25μlの反応で増幅されることを意味、三重に増幅を行います。各プライマー対で無テンプレート水の制御を実行します。汚染の導入を避け、迅速しかし注意深く作業してください。 個々のキャップで8ウェルストリップをラベルし、PCRクーラーに配置します。 最初にピペットでマスターミックス90μlのよく。 リバースプライマー（ 補足ファイル1）の2μlを添加します。慎重に、表1に各サンプルに使用されるリバースプライマーのバーコードをメモしておいてください。 よく混ぜ、第四ウェル（無鋳型対照）にマスターミックス23μLを移します。 第四のウェルに水の2μLを加えます。 最初のウェルに適切なサンプルの6μlを添加します。よく混合し、第2のウェルに25μlのを転送します。変更のヒントと第3ウェルに第一のウェルから別の25μlのを転送します。しっかりと処理中のウェルまたはキャップの内側に触れないように確認しながら、すべてのよくキャップ。 各サンプルについて、この手順を繰り返します。 PCR増幅を行いますサーモサイクラーにストリップチューブを移し、次のプログラムを実行します。続いて98℃で10秒間の30サイクル、57℃で30秒間、および72℃で12秒、続いて98°C、で30秒10分は、72℃、最終保持aで開催しますトン4°C。 クリーン実験台で次の手順を実行します。迅速壁から液体を収集するためにチューブをスピン。滅菌ラベルされたチューブに、75μlの総容量で、各試料から三連のPCR反応を兼ね備えています。また、別々の滅菌チューブにそれぞれ無鋳型対照の25μLを移します。まだ異なるサンプルからのアンプリコンを結合しないでください。 ゲル電気泳動によるサンプルの成功したPCR増幅の検証。 各アンプリコン、水管理、及びラダー21を保持するのに十分な井戸を用いて1.5％アガロースゲル（1×TAEバッファーの100ミリリットル中1.5グラムアガロース粉末）を準備します。 ゲルが硬化（約30分）が、泳動用のサンプルを準備する：新しい、ラベルされたチューブに6Xローディング色素の1μLを加えます。そのチューブに、アンプリコンの5μlを添加し、ピペッティングにより混合します。 ゲルが設定したときは、櫛を削除する電気泳動槽にゲルを置き、1×TAE緩衝液でタンクを満たし。 </li> 第一のウェルに、DNAラダーの5μlを添加。 別のウェルにロードしたサンプルアンプリコンの5μLを。負荷の別々のウェルに無鋳型アンプリコンの5μlの。各試料について、必要に応じて続行します。 すべてのサンプルがロードされたときは、所定の位置にタンクのふたをスライドさせ、120に電源をオンにV.ゲルは30のために実行を許可する – 60分。 UV光下でゲルを表示します。 380bpの周りに単一の強いバンドに​​注目することによって、各試料の増幅の成功を確認してください。二重のバンドがある場合は、別の逆バーコード（ステップ2.3）でサンプルを再増幅します。全くバンドが存在しない場合は、同じ逆バーコードや新しい逆バーコード（ステップ2.3）のいずれかを使用してサンプルを再増幅します。再増幅に失敗した場合、PCR阻害剤は、PCR阻害物質を除去するためにカラムベースのDNAクリーンアップを実行する場合には、試料中に存在することができます。 注：成功した増幅が可能ではないかもしれない場合における細菌のDNA濃度またはiginalサンプルが不十分（<5 ngの/μL）です。 無鋳型対照のバンドが存在しないことに注目することによって、試薬の汚染がないことを確認します。 -20℃でアンプリコンの残りの70μLを保管してください。それはバンドが得られなかったと仮定し、無テンプレートコントロールの残りの20μLを捨てます。 3.図書館プールとハイスループットシーケンシング単一の滅菌チューブに各アンプリコンの – （5μlの2）等容積を組み合わせることにより、アンプリコンプールを作成します。サンプルからのバンドが特に弱い見えた場合は、サンプルの残りの部分に2倍容量の相対を追加します。 製造元の指示22以下、PCRクリーンアップキットを使用して、アンプリコンプールからPCRプライマーを削除します。アンプリコンのプールボリュームが100μlの上にある場合は、複数の列でクリーンアップを実行します。注：各列は100μlの容量を有します。 -20＆＃でライブラリを保存176; Cまたは次のステップに進みます。 該当する場合は、最終的なライブラリーを作成するために、プライマーを含まないアンプリコンプールを兼ね備えています。分光光度計や蛍光システム23を使用して、ライブラリのDNA濃度を決定します。 1.8の間で260/280比 – 2.0は、純粋なDNAの指標です。 20 nMのにライブラリを希釈します。電気泳動装置を用いて400 bpの周りに単一のバンドを可視化することによって、ライブラリの品質を確認してください。蛍光システム23を使用して、ライブラリの濃度を確認してください。 2 nmのライブラリーを希釈するために水に最終1:10希釈を行います。次に、無期限に20℃でライブラリを保存します。 必要な3つの配列決定プライマーを用いて、最終的なライブラリーのアリコートを送る（、1を読む2を読み、インデックス、マテリアル/機器の表を参照）イルミナシーケンサーで配列決定するために。 300未満のサンプルは、配列決定のために多重化されている場合は、Oシングルエンド300bpのランを使用し、12 bpのインデックスで読み取ります5 PMの最終ライブラリー濃度と10％の変性PHIXスパイク付きのMiSeq、ナ。詳細なシーケンシング手順についてCaporaso ら ISME J、2012 10の補足資料を参照してください。 4.配列分析注：ここで説明はQIIME 1.8.0ソフトウェアパッケージを使用して、配列解析のための基本的なパイプラインです。簡単にするために、提供されているコマンドは、12 bpのインデックスファイルがindex.fastqと呼ばれ、300 bpのシークエンスは、ファイルがsequences.fastqと呼ばれて読んで読んで、マッピングファイルがmapping.txtと呼ばれていることを前提としています。 QIIMEまたはMacQIIME 16をインストールし、これらのコマンドを実行するには、UNIXの基本を理解しておきます。でQIIMEへの完全なガイドを読みます： 実験（ 表1）のためのマッピングファイルを完了します。できるだけ多くのメタデータを含みます。バッチ効果があるかどうかを決定するために、サンプルを抽出または同一バッチ内で増幅されたメモ。 <l私> 例えば、mapping.txt、テキストファイルとしてマッピングファイルを保存します。次のコマンドを実行してマッピングファイルのフォーマットを検証します。validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o mapping_output 注意：このコマンドは、もしあれば、マッピングファイルのエラーを示す.htmlのファイルを含む、「mapping_output」と呼ばれる新しいフォルダを、作る組み込みの "validate_mapping_file.py」QIIMEのスクリプトを使用しています。 シーケンシングの品質を確認することは、FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）として、プログラムをチェックし、高スループットシーケンスデータの品質を使用して読み取ります。 図5は、塩基当たりシーケンスの品質を実証しますそれが成功の実行から期待することができます。 注：シーケンサは、ベースが誤って呼び出されていることを確率に対応する各ヌクレオチドベースPhredクオリティスコアを割り当てます。 10のPhredクオリティスコアは、ヌクレオチドが誤って割り当てられていることを10％の確率があることを示しますedは、20 30、0.1％の確率を示し、1％の確率を示し、40（可能な限り最高のスコアが）0.01％の確率で24を示しています。 キーとしてマッピングファイルを使用して、逆多重化、品質フィルタ配列決定データは、このコマンド25を実行することにより、（「sl_out」と呼ばれるこの場合には、）フォルダに結果を保存します。split_libraries_fastq.py –rev_comp_mapping_barcodes -i sequences.fastq -o sl_out / -b index.fastq -m mapping.txt -q 29 注：Qフラグが最大許容できないPhredクオリティスコアを示し、 例えば、「-q 29は、「ベースコールの99.9％の精度を確保、30以下PHREDスコアを有する任意の配列が除外されます。 Greengenes 16S操作的分類単位（OTU）リファレンス・データベース26（http://qiime.org/home_static/dataFiles.html）を使用して、このコマンド27を実行することで、オープン参照OTUピッキング実行します。pick_open_reference_otus.py -i sl_out / seqs。 FNA -r 97_otus.fasta -o ucrss / -s 0.1 注：-sフラグがデノボクラスタリングに含まれる参照データベースに整列させるために失敗したシーケンスの一部。 「0.1 -s " デノボクラスタリングで失敗した配列の10％が含まれています。 OTUピッキングプロセスを並列化し、複数のコアが利用可能な場合は時間に日から処理時間を短縮するために-aフラグを使用してください。 summarize_taxa.py -i ucress / otu_table_mc2.biom -o summarized_otuSpecies / -L 7：28このコマンドを実行することにより、種レベルでOTUsをマージすることにより、ユーザーフレンドリーな分類学的豊かさのテーブルを作成します。 注：結果のテーブルには、簡単に任意の表計算ソフトで表示することができます。 16SのrRNA塩基配列決定が確実に種レベルの分解能を提供しないことに注意してください。 QIIMEスクリプトalpha_diversity.pyで数アルファ多様性の指標を計算することによって、各サンプル内の生態系の多様性を決定します。そして、QIIMEスクリプトbeta_diversity.pyを使用して、サンプルの対間の多様性を決定します。 ビスデータをualize、 例えば 、天皇29プリンシパルを使用して、プロットやヒートマップを調整します。 QIIMEのcompare_catagories.pyスクリプト30で、例えば 、マッピングファイルカテゴリの正式な統計的比較を実行します。