Claro conduzido enzimática descarboxilação

Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos usados ​​nestas sínteses são altamente tóxicos e cancerígenos. Todas as etapas que envolvem solventes orgânicos prejudiciais à saúde, especialmente a extração dos produtos da reacção e da derivação de ácidos graxos deve ser realizado sob um exaustor utilizando equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calças compridas, sapatos fechados ). Todas as operações que envolvam organismos geneticamente modificados neste trabalho necessitam de instalações que são aprovados para a manipulação de organismos geneticamente modificados do S1 nível de segurança. 1. A expressão da descarboxilase recombinante em E. OLET JE coli Preparação da estirpe de produção Preparar um gene sintético de JE a partir OLET Jeotgalicoccus e clonado no vector de expressão de pASK-IBA37plus como descrito. 8 </sup> NOTA: Para evitar a degradação de ácidos graxos por enzimas do metabolismo bacteriano, E. foi usada coli estirpe JW5020 da coleção Keio com um caminho disfuncional para a degradação de ácidos graxos. O cultivo e a indução da expressão da enzima Prepara-se uma pré-cultura por inoculação a E. coli JW5020 OLET mutante a partir de uma placa de LB-(contendo 100? g ml-1 de ampicilina) em dois 3 ml de LB médio em tubos de ensaio. Pipeta ampicilina (100 ug mL-1) a partir de uma solução de estoque para o meio de selecção e incubar a 37 ° C durante 15 h num incubador com agitação a 180 rpm. Adicionar 2 ml das pré-culturas para dois 200 ml de LB médio, contendo ampicilina (100 ug mL-1), em frascos de 1 L de agitação. A incubação decorre a 37 ° C e 180 rpm. Monitorar a mudança de 600nm OD após a inoculação. Quando a DO600 atinge um valor entre 0,6 umd 0,8 induzir a expressão por adição de tetraciclina (0,2 mg ml-1). Incubam-se as culturas durante 15 horas a 20 ° C e 180 rpm. Observação: Uma vez que OLET JE contém um cofactor do heme, é necessária a adição de ácido levulínico δ-amino (0,5 mM) antes da indução para proporcionar a cultura com um precursor para a síntese do co-factor. A lise celular Realizar os seguintes passos no gelo. Transferir as culturas por decantação ou pipetagem para tubos de centrífuga e usar uma escala para assegurar a igualdade de distribuição. Centrifugar as culturas durante 20 min a 12000 xg, a 4 ° C. Cuidadosamente descartar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 50 ml de tampão (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) por pipetagem e transferir a suspensão em um tubo de centrífuga cónico. Após centrifugação durante 15 min a 4000 xg, a 4 ° C descartar o sobrenadante, ressuspender cada sedimento em 3 ml de tampão por pipetagem. Realizar a lise celular por assimnicar as soluções em gelo (três ciclos x 30 s), deixando uma pausa de 1 min entre os ciclos. Centrifugar as soluções durante 20 minutos a 15000 xg, a 4 ° C para remover os restos de células e transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação cónico, sem perturbar o sedimento por pipetagem. Descartar o sedimento. NOTA: Uma fracção de solvente será utilizado directamente para a biocatálise depois de moléculas pequenas são removidos. A segunda fracção irá ser utilizada para a purificação do OLET JE marcada com His. A remoção de pequenas moléculas de adesão célula-extractos Antes de utilizar o extracto em bruto na biocatálise remover pequenas moléculas que possam interferir com a formação de peróxido de hidrogénio ou a transferência de electrões por pipetagem 3 ml de extracto isento de células numa unidade de filtro de centrifugação, utilizando uma membrana de 10 kDa e centrifugar a 4000 xg, a 4 ° C. Ressuspender a proteína restante em 3 ml de Tris-HCl-tampão. A purificação do OLET </strong> Aplicar 3 ml de extracto celular a segunda aos Seus colunas de giro Pur Ni-NTA, que tenham sido equilibrada antes com tampão de equilíbrio (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). Selar as colunas com os plugues de fundo e parafuso-tampões superiores e agitá-los levemente até que a resina é distribuído igualmente com o extrato livre de células. Incubar as colunas carregadas durante 30 min num agitador vertical, a 4 ° C. Lavam-se as colunas com 1 ml de tampão de lavagem (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) por centrifugação a 700 xg durante 2 min. Repita esta etapa duas vezes. Colocar as colunas para um tubo de centrifugação cónico fresca e adicionar 1 ml de tampão de eluição (Tris a 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Centrifugar a 700 xg durante 2 minutos e repita esta etapa duas vezes. NOTA: Imidazole se ligará ao níquel e, assim, remover OLET JE a partir da coluna. Transfira a eluição de uma unidade de filtro de centrífuga (10 mem kDabrana) e centrifugar a 4000 xg, a 4 ° C para remover o imidazole. Verifique a pureza da enzima por um SDS-PAGE (15%). 9 3 ul da mistura da eluição com um tampão de SDS-(1x concentração final) e incubar a solução a 95 ° C durante 5 min para a desnaturação. Subsequentemente aplicam-se a quantidade total de uma SDS-PAGE. Submeter o gel a 35 mA utilizando um padrão de proteína comerciais. Detectar a proteína de 50 kDa. Para determinar a concentração de proteína disponível usar um BSA-kit comercial. Pipetar 50 ul de amostras de proteína (diluído 1: 100, 1: 200, 1: 500) e o padrão de BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg mL -1) em uma placa de 96 poços . Adicionar 200 ul de reagente de Bradford, medir a absorvância a 595 nm após 15 min com um fluorímetro e calcular as concentrações utilizando a curva padrão. 2. Biotransformação de luz catalisada Reacções biocatalíticas sem adição de peróxido de hidrogénio Prepara-se uma solução de 10 ml de estoque de 10 mM de ácido esteárico (M r 284,5 g mol-1) por adição de 10% (v / v) de Tergitol e 0,0284 g de ácido esteárico a água destilada. Aquece-se a solução em uma câmara de aquecimento a 60 ° C até que o ácido gordo é completamente dissolvido. Biocatálise e amostragem Preparar dois 2 ml misturas reaccionais contendo 50 mM de EDTA, 0,01 mM de FMN, ácido esteárico 0,5 mM em Tris-HCl-tampão. Adicionar uma barra de agitação magnética para fornecimento de oxigénio suficiente e colocar os tubos de vidro num banho de água, aquecida a 25 ° C. Adicionar 200? G ml -1 de enzima purificada ou 10% (v / v) extracto isento de células de cada uma das misturas de reacção e iluminar-los com uma ampola de vidro clara (120 W) em 15 cm de distância dos tubos de reacção. Aqui amostras de 200 ul em pontos de tempo específicos (0, 10, 30, 60 e 120 min) e durante a noite a paragem da reacção com HCl a 20 ul de 37%. Adicionar 5 mL de ácido mirístico (10 mM de modolução) como padrão interno. Análise dos produtos de reacção Para a extracção adicionar 500 mL de acetato de etilo às amostras duas vezes, inverter os tubos e centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. Tire 400 ul do sobrenadante e deixar o solvente evaporar completamente. Derivatizar os ácidos carboxílicos em ácido trimethylsilylcarboxylic por adição de 200 uL de N-metil-N – (trimetilsilil) trifluoro- acetamida (MSTFA). Incubar a solução a 60 ° C durante 30 minutos, a fim de converter os grupos hidroxilo para trimetilsilil éteres. Determinação de conversão por GC / FID NOTA: Determinar a formação de 1-heptadeceno (RT: 8,34 min), ácido esteárico e α- β-hidroxi (RT: 12,05 e 12,1 min) e diminuição do substrato (RT: 11,15 min) utilizando GC / FID. Defina o perfil de temperatura descrito abaixo Defina a temperatura de injecção de 340 ° C. Aguardea temperatura do forno inicial é a 90 ° C durante 3,5 min e, subsequentemente, aumentar a 45 ° C min-1. A 220 ° C, mantida a temperatura durante 2 min. Depois de um aumento repetido de 45 ° C min @ 1, manter a temperatura a 280 ° C durante 2 min e, em seguida, aumentam com a 60 ° C min-1. NOTA: A temperatura máxima de 330 ° C é mantida por 1,44 min. Injectar 4 ul da amostra, com uma razão de divisão de 5 a obter a volatilização rápida e a mistura homogénea com o hélio gás portador. NOTA: Em dependência do aumento da temperatura do substrato e dos produtos vai entrar na fase gasosa. As substâncias são detectados pelo detector / FID GC após a passagem da coluna a tempos de retenção específicos e são apresentados como picos no ecrã. Observar a formação de pico no monitor. Calcula-se a concentração do produto formado pela seguinte fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> NOTA: O factor de calibração foi determinada especificamente para esta coluna para cada substrato e do produto através do cálculo da curva padrão a partir de quantidades conhecidas de substâncias derivadas e sua área de pico correspondente. Identificar picos de ácidos olefínicos e beta-hidroxi por GC / MS. Identificar picos de ácidos olefínicos e beta-hidroxi por GC / MS. Defina o perfil de temperatura. Ajustar a temperatura de injecção de 250 ° C. Mantenha a temperatura do forno a 100 ° C durante 5 min e, subsequentemente, aumentar a 20 ° C min-1. NOTA: Máximo temperatura é mantida por 7,5 min. Ajustar a temperatura do detector espectrómetro de massa a 250 ° C e digitalizar a de 50 a 500 m / z no modo de impacto de electrões. NOTA: A ionização por impacto remove um único electrão resultando na formação de um catião radical que irá ser passada para a frente para análise de massa. Devido às altas ligações covalentes energia intramolar dentro domolécula quebra criando fragmentos de menor m / z. Estes fragmentos formar uma impressão digital específica para uma substância. Injectar 1 ul da amostra. Detectar 1-heptadeceno após o tempo de retenção de 11,4 minutos por a impressão digital correspondente (Figura 2).