Impulsada por la luz enzimática descarboxilación

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son muy tóxico y cancerígeno. Todas las etapas que implican disolventes orgánicos nocivos, en particular la extracción de los productos de reacción y la derivatización de los ácidos grasos deben llevarse a cabo bajo una campana de extracción usando el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados ). Todas las operaciones que implican organismos modificados genéticamente en este trabajo requieren instalaciones que están aprobados para el manejo de organismos modificados genéticamente del nivel de seguridad S1. 1. Expresión de la descarboxilasa recombinante en E. OLET JE coli Preparación de la cepa de producción Preparar un gen sintético de OLET JE de Jeotgalicoccus y se clonó en el vector de expresión pASK-IBA37plus como se describe. 8 </sup> NOTA: Para evitar la degradación de los ácidos grasos por las enzimas del metabolismo bacteriano, E. se utilizó coli cepa JW5020 de la colección de Keio con una vía disfuncional para la degradación de ácidos grasos. El cultivo y la inducción de la expresión de la enzima Preparar un precultivo inoculando la E. coli JW5020 OLET mutante de una placa de LB-(que contiene 100 mg ml -1 ampicilina) en dos de 3 ml de medio LB en tubos de ensayo. Ampicilina pipeta (100 mg ml -1) de una solución madre en el medio de selección y se incuba a 37 ° C durante 15 horas en una incubadora de agitación a 180 rpm. Añadir 2 ml de las culturas pre-dos 200 ml de medio LB, que contenía ampicilina (100 mg ml -1), en 1 L de frascos de agitación. La incubación tiene lugar a 37 ° C y 180 rpm. Monitorear el cambio en OD 600nm después de la inoculación. Cuando el OD 600 alcanza un valor entre 0.6 unad 0,8 inducir la expresión mediante la adición de tetraciclina (0,2 mg ml -1). Incubar los cultivos durante 15 horas a 20 ° C y 180 rpm. NOTA: Como OLET JE contiene un cofactor hemo, es necesaria la adición de ácido levulínico δ-amino (0,5 mM) antes de la inducción para proporcionar el cultivo con un precursor para la síntesis de cofactor. La lisis celular Llevar a cabo los siguientes pasos en el hielo. La transferencia de las culturas por decantación o pipeteo en tubos de centrífuga y el uso de una escala para garantizar la igualdad de distribución. Centrifugar los cultivos durante 20 minutos a 12.000 xga 4 ° C. desechar con cuidado el sobrenadante y volver a suspender los pelets en 50 ml de tampón (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) mediante pipeteo y la transferencia de la suspensión en un tubo de centrífuga cónico. Después de la centrifugación durante 15 minutos a 4000 xga 4 ° C descartar el sobrenadante, resuspender cada sedimento en 3 ml de tampón por pipeteado. Realizar la lisis celular por lonicating las soluciones en hielo (tres ciclos x 30 seg), dejando una pausa de 1 minuto entre los ciclos. Centrifugar las soluciones durante 20 min a 15.000 xg a 4 ° C para eliminar los desechos de células y transferir el sobrenadante a un tubo de centrifugación cónico sin perturbar el sedimento por pipeteado. Se desecha el precipitado. NOTA: Una fracción de disolvente se puede utilizar directamente para la biocatálisis después de moléculas pequeñas se eliminan. La segunda fracción será utilizado para la purificación de la Su-etiquetados OLET JE. La eliminación de pequeñas moléculas de celulares extractos Antes de usar el extracto crudo en la biocatálisis eliminar pequeñas moléculas que podrían interferir con la formación de peróxido de hidrógeno o de transferencia de electrones con la pipeta 3 ml de extracto libre de células en una unidad de filtro de centrífuga con una membrana y se centrifuga 10 kDa a 4000 xga 4 ° C. Resuspender la proteína restante en 3 ml de Tris-HCl-buffer. La purificación del OLET </strong> Aplicar 3 ml de la segunda extracto celular a sus columnas de centrifugación Pur Ni-NTA, que han sido equilibrada con tampón de equilibrio antes de (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). Sellar las columnas con los tapones inferiores y superiores tapones de rosca y agitar ligeramente hasta que la resina se distribuye por igual con el extracto libre de células. Incubar las columnas cargadas de 30 min en un agitador de cabeza a 4 ° C. Lavar las columnas con 1 ml de tampón de lavado (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) por centrifugación a 700 xg durante 2 min. Repita este paso dos veces. Colocar las columnas en un tubo de centrifugación cónico fresco y añadir 1 ml de tampón de elución (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Centrifugar a 700 xg durante 2 minutos y repetir este paso dos veces. NOTA: El imidazol se unirá a níquel y por lo tanto eliminar OLET JE de la columna. La transferencia de la elución de una unidad de filtro de centrífuga (10 kDa membrana) y centrifugar a 4000 xg a 4 ° C para eliminar el imidazol. Comprobar la pureza de la enzima por una SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 l de la elución con un tampón de SDS-(1x concentración final) e incubar la solución a 95 ° C durante 5 min para la desnaturalización. Posteriormente aplicar la cantidad total en una SDS-PAGE. Correr el gel a 35 mA usando un patrón de proteína comercial. Detectar la proteína a 50 kDa. Para determinar la concentración de proteína disponible utilizar un BSA-kit comercial. Pipeta de 50 l de proteína de las muestras diluidas (1: 100, 1: 200, 1: 500) y patrón de BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) en una placa de 96 pocillos . Añadir 200 l de reactivo de Bradford, medir la absorbancia a 595 nm después de 15 min con un fluorímetro y calcular las concentraciones usando la curva estándar. 2. Biotransformación-Light catalizada Reacciones biocatalíticas sin adición de peróxido de hidrógeno Preparar una solución de 10 ml de stock de 10 mM de ácido esteárico (M r 284,5 g mol -1) mediante la adición de 10% (v / v) Tergitol y 0,0284 g de ácido esteárico a agua destilada. Calentar la solución en una cámara de calentamiento a 60 ° C hasta que el ácido graso está completamente disuelto. Biocatálisis y toma de muestras Preparar dos 2 ml de mezclas de reacción que contienen mM EDTA 50, FMN 0,01 mM, ácido esteárico 0,5 en Tris-HCl-buffer. Añadir una barra de agitación magnética para el suministro de oxígeno suficiente y colocar los tubos de vidrio en un baño de agua, se calentó a 25 ° C. Añadir 200 g ml-1 de enzima purificada o 10% (v / v) de extracto libre de células a cada uno de las mezclas de reacción y iluminarlos con una bombilla de vidrio transparente (120 W) en 15 cm de distancia de los tubos de reacción. Tomar muestras de 200 l en puntos de tiempo específicos (0, 10, 30, 60 y 120 min y durante la noche) detener la reacción con HCl 20 l 37%. Añadir 5 l de ácido mirístico (10 mM de modolución) como estándar interno. Análisis de productos de la reacción Para la extracción de añadir 500 l de acetato de etilo a las muestras dos veces, invertir los tubos y centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. Despegue 400 l del sobrenadante y dejar que el disolvente se evapore por completo. Derivatizar los ácidos carboxílicos en ácido trimethylsilylcarboxylic mediante la adición de 200 l N -metil- N – (trimetilsilil) trifluoro acetamida (MSTFA). Incubar la solución a 60 ° C durante 30 min con el fin de convertir los grupos hidroxilo para trimetilsilil éteres. Determinación de la conversión mediante GC / FID NOTA: Determinar la formación de 1-heptadeceno (RT: 8,34 min), ácido esteárico α- y β-hidroxi (RT: 12,05 y 12,1 min) y la disminución del sustrato (RT: 11,15 min) utilizando GC / FID. Establecer el perfil de temperatura se describe a continuación Configurar la temperatura de inyección de 340 ° C. Sostenerla temperatura inicial de la estufa es a 90 ° C durante 3,5 min y posteriormente se incrementa con 45 ° C min-1. A 220 ° C, mantener la temperatura durante 2 minutos. Después de un aumento repetido de 45 ° C min-1, mantenga la temperatura a 280 ° C durante 2 minutos y luego aumentar con 60 ° C min-1. NOTA: La temperatura máxima de 330 ° C se mantuvo durante 1,44 minutos. Inyectar 4 l de la muestra, con una relación de división de 5 para obtener la volatilización rápida y mezcla homogénea con el helio gas portador. NOTA: En función de la temperatura creciente del sustrato y los productos entrarán en la fase de gas. Las sustancias son detectadas por el detector / FID GC después de pasar a la columna en tiempos de retención específicos y se muestran como los picos en la pantalla. Observar la formación de pico en el monitor. Calcular la concentración de producto formado por la siguiente fórmula: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> NOTA: El factor de calibración se ha determinado específicamente para este columna para cada sustrato y el producto mediante el cálculo de la curva estándar de cantidades conocidas de las sustancias derivatizadas y su área del pico correspondiente. Identificar los picos de ácido de olefinas y beta-hidroxi por GC / MS. Identificar los picos de ácido de olefinas y beta-hidroxi por GC / MS. Establecer el perfil de temperatura. Ajuste la temperatura de inyección de 250 ° C. Mantenga la temperatura del horno a 100 ° C durante 5 minutos y posteriormente se incrementará con 20 ° C min-1. NOTA: La temperatura máxima se mantiene durante 7,5 min. Ajuste la temperatura del detector espectrómetro de masas a 250 ° C y escanear de 50 a 500 m / z en el modo de impacto electrónico. NOTA: Electron ionización de impacto elimina un solo electrón como resultado la formación de un catión radical que se hace pasar hacia adelante para el análisis de masas. Debido a los altos enlaces covalentes de energía dentro de la intramolarruptura molécula de la creación de fragmentos de menor m / z. Estos fragmentos forman una huella digital específica para una sustancia. Se inyecta 1 l de la muestra. Detectar 1-heptadeceno después de 11,4 min Tiempo de retención por la huella digital correspondiente (Figura 2).