Enzimatica decarbossilazione Luce-driven

Attenzione: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Molti dei prodotti chimici utilizzati in queste sintesi sono altamente tossici e cancerogeni. Tutte le fasi che coinvolgono solventi organici nocivi, in particolare l'estrazione dei prodotti di reazione e la derivatizzazione di acidi grassi devono essere effettuate sotto una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni full-length, scarpe chiuse ). Tutte le operazioni che coinvolgono organismi geneticamente modificati in questo lavoro richiedono installazioni che sono stati approvati per la gestione di organismi geneticamente modificati della S1 livello di sicurezza. 1. L'espressione della ricombinante decarbossilasi olet JE in E. coli Preparazione del ceppo produttivo Preparare un gene sintetico di Olet JE dal Jeotgalicoccus e clonato nel vettore di espressione PASK-IBA37plus come descritto. 8 </sup> NOTA: Per evitare la degradazione degli acidi grassi dagli enzimi del metabolismo batterico, E. coli ceppo JW5020 della collezione Keio con un percorso disfunzionale per la degradazione degli acidi grassi è stato utilizzato. La coltivazione e l'induzione di espressione dell'enzima Preparare una pre-cultura inoculando la E. coli JW5020 olet mutante da un LB-plate (contenente 100 mg ml -1 ampicillina) in due 3 ml di LB-media in provetta. Pipetta ampicillina (100 ug ml -1) da una soluzione madre nel mezzo di selezione e incubare a 37 ° C per 15 h in un incubatore agitazione a 180 rpm. Aggiungere 2 ml di pre-culture di due 200 ml di LB-media, contenente ampicillina (100 mg ml -1), in 1 fiaschi L agitare. Incubazione procede a 37 ° C e 180 rpm. Monitorare il cambiamento di OD 600nm dopo l'inoculazione. Quando la OD 600 raggiunge un valore compreso tra 0,6 und 0.8 indurre l'espressione con l'aggiunta di tetraciclina (0,2 mg ml -1). Incubare le culture per 15 ore a 20 ° C e 180 rpm. NOTA: Poiché Olet JE contiene un cofattore eme, è necessaria aggiunta di acido levulinico δ-Amino (0,5 mM) prima dell'induzione di fornire la cultura con un precursore per la sintesi cofattore. La lisi cellulare Eseguire i seguenti passi sul ghiaccio. Trasferire le culture per decantazione o pipettando nella provette da centrifuga e utilizzare una scala per garantire la parità di distribuzione. Centrifugare le colture per 20 min a 12.000 xg a 4 ° C. Eliminare attentamente il supernatante e risospendere il pellet in 50 ml di tampone (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) pipettando e trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga conica. Dopo centrifugazione per 15 min a 4000 xga 4 ° C scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 3 ml di tampone pipettando. Eseguire la lisi cellulare da cosìnicating le soluzioni su ghiaccio (tre cicli x 30 sec) lasciando un 1 minuto di pausa tra i cicli. Centrifugare le soluzioni per 20 min a 15.000 xg a 4 ° C per rimuovere detriti cellulari e trasferire il surnatante in un tubo di centrifugazione conica senza disturbare il pellet pipettando. Eliminare il pellet. NOTA: Una frazione solventi sarà utilizzato direttamente per biocatalisi dopo piccole molecole vengono rimossi. La seconda frazione sarà utilizzata per la purificazione del His-tag Olet JE. La rimozione di piccole molecole di Cell-estratti Prima di utilizzare l'estratto grezzo in biocatalisi rimuovere piccole molecole che possono interferire con la formazione di perossido di idrogeno o trasferimento elettronico pipettando 3 ml di estratto cellulare in un'unità filtrante centrifuga con 10 kDa membrana e centrifugare a 4000 xga 4 ° C. Risospendere la proteina residua in 3 ml di Tris-HCl-buffer. Purificazione di Olet </strong> Applicare 3 ml del secondo estratto cellulare ai suoi Pur Ni-NTA colonne di rotazione, che sono stati equilibrati prima con tampone di equilibrazione (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 10 mM). Sigillare le colonne con i tappi di fondo e tappi a vite superiore e stringere leggermente fino a quando la resina viene distribuito equamente con l'estratto cellulare. Incubare le colonne caricate per 30 min in un agitatore testa a 4 ° C. Lavare le colonne di 1 ml di tampone di lavaggio (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 7,4) per centrifugazione a 700 xg per 2 minuti. Ripetere questa operazione due volte. Posizionare le colonne in un tubo di centrifugazione conica fresco e aggiungere 1 ml di tampone di eluizione (Tris 20 mM, NaCl 300 mm, 250 mm imidazolo, pH 7,4) olet JE. Centrifugare a 700 g per 2 minuti e ripetere l'operazione due volte. NOTA: Imidazole si legherà al nichel e quindi rimuovere olet JE dalla colonna. Trasferire il eluizione di un gruppo filtro centrifuga (10 mem kDabrane) e centrifugare a 4000 xga 4 ° C per rimuovere imidazolo. Controllare la purezza dell'enzima da un SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 microlitri della eluizione con SDS-buffer (1x concentrazione finale) e incubare la soluzione a 95 ° C per 5 minuti per denaturazione. Successivamente applicare la quantità totale su un SDS-PAGE. Attivare il gel a 35 mA utilizzando uno standard commerciale proteine. Rilevare la proteina a 50 kDa. Per determinare la concentrazione proteica utilizzare una disposizione BSA-kit commerciale. Pipettare 50 ml di campioni di proteine ​​diluito (1: 100, 1: 200, 1: 500) e standard di BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in una piastra a 96 pozzetti . Aggiungere 200 ml di reagente di Bradford, misurare l'assorbanza a 595 nm dopo 15 min con un fluorimetro e calcolare le concentrazioni utilizzando la curva standard. 2. Biotrasformazione Light-catalizzata Le reazioni biocatalitici senza aggiunta di perossido di idrogeno Preparare una soluzione di 10 ml di 10 mM di acido stearico (M r 284,5 g mol -1) aggiungendo 10% (v / v) tergitol e 0,0284 g di acido stearico di acqua distillata. Riscaldare la soluzione in una stufa a 60 ° C fino l'acido grasso è completamente sciolto. Biocatalisi e campionamento Preparare due 2 ml miscele di reazione contenenti 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM acido stearico in Tris-HCl-buffer. Aggiungere una barra di agitazione magnetica per apporto di ossigeno sufficiente e posizionare i tubi di vetro in un bagno d'acqua, riscaldata a 25 ° C. Aggiungere 200 mg ml -1 di enzima purificato o 10% (v / v) estratto cellulare a ciascuna delle miscele di reazione e illuminare con una lampadina di vetro chiaro (120 W) in 15 cm di distanza delle provette di reazione. Prendere 200 campioni microlitri in punti temporali specifici (0, 10, 30, 60 e 120 min e durante la notte) fermare la reazione con 20 l 37% di HCl. Aggiungere 5 ml di acido miristico (10 mM magazzino cosìluzione) come standard interno. Analisi dei prodotti di reazione Per l'estrazione aggiungere 500 microlitri di acetato di etile ai campioni due volte, invertire i tubi e centrifugare per 1 min a 13.000 x g. Togliere 400 ml di surnatante e lasciare che il solvente completamente evaporare. Derivatize gli acidi carbossilici in acido trimethylsilylcarboxylic aggiungendo 200 microlitri N -methyl- N – (trimetilsilil) acetammide trifluoro (MSTFA). Incubare la soluzione a 60 ° C per 30 minuti per convertire i gruppi ossidrilici di trimetilsilil etere. Determinazione della conversione in GC / FID NOTA: Determinare la formazione di 1-eptadecene (RT: 8,34 min), acido stearico α- e β-idrossi (RT: 12.05 e 12.1 min) e la diminuzione del substrato (RT: 11,15 min) mediante GC / FID. Impostare il profilo di temperatura descritto di seguito impostare la temperatura di iniezione a 340 ° C. tenerela temperatura iniziale del forno è a 90 ° C per 3,5 minuti e successivamente aumenta a 45 ° C min -1. A 220 ° C, mantenere la temperatura per 2 min. Dopo un ripetuto aumento di 45 ° C min -1, mantenere la temperatura a 280 ° C per 2 minuti e poi aumentare con 60 ° C min -1. NOTA: La temperatura massima di 330 ° C è tenuto per 1.44 min. Iniettare 4 ml di campione, con un rapporto di divisione di 5 per ottenere una rapida volatilizzazione e miscelazione omogenea con elio gas di trasporto. NOTA: In dipendenza dalla temperatura crescente substrato e prodotti entreranno nella fase gassosa. Le sostanze sono rilevati dal rilevatore / FID GC dopo aver superato la colonna in tempi di ritenzione specifici e vengono visualizzati come picchi sullo schermo. Osservare la formazione del picco sul monitor. Calcolare la concentrazione di prodotto formato dalla seguente formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> NOTA: Il fattore di calibrazione è stata determinata specificamente per questa colonna per ogni substrato e prodotto calcolando la curva standard dalla quantità note delle sostanze derivatizzati e la loro area del picco corrispondente. Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. Identificare i picchi di acido olefine e beta-idrossi mediante GC / MS. Impostare il profilo di temperatura. Impostare la temperatura di iniezione a 250 ° C. Mantenere la temperatura del forno a 100 ° C per 5 minuti e poi aumentare a 20 ° C min -1. NOTA: massima temperatura viene mantenuta per 7,5 min. Impostare la temperatura del rivelatore spettrometro di massa a 250 ° C e la scansione da 50 a 500 m / z in modalità impatto elettronico. NOTA: Electron impatto ionizzazione rimuove un singolo elettrone causando la formazione di un catione radicale che verrà passato in avanti per l'analisi di massa. A causa dei legami covalenti energia intramolar alte all'interno delpausa molecola creando frammenti di bassa m / z. Questi frammenti formano un'impronta digitale specifico per una sostanza. Iniettare 1 ml di campione. Detect 1-eptadecene dopo 11.4 min Tempo di ritenzione dal corrispondente impronta digitale (Figura 2).