Легкий управляемый Ферментативный Декарбоксилирование

Внимание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в этих синтезов остро токсичными и канцерогенными. Все шаги, связанные вредные органические растворители, в частности извлечение продуктов реакции и модифицирования жирных кислот должны выполняться под вытяжкой с использованием средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полнометражные брюки, закрытые носок обуви ). Все операции, связанные с использованием генетически модифицированных организмов в этой работе требуют установки, которые утверждены для обработки генетически модифицированных организмов уровня безопасности S1. 1. Экспрессия рекомбинантного декарбоксилазы OLET JE в E. палочки Подготовка производственного штамма Готовят синтетический ген OLET JE из Jeotgalicoccus и клонировали в вектор экспрессии ПАСК-IBA37plus , как описано. 8 </sup> Примечание: Для того, чтобы избежать деградации жирных кислот ферментами из бактериального метаболизма, E. был использован штамм E.coli JW5020 из коллекции Кейо с неблагополучной пути к деградации жирных кислот. Выращивание и индукция экспрессии фермента Подготовка предварительной культуры путем инокуляции Е. палочка JW5020 OLET мутант из LB-пластинки (содержащей 100 мкг мл -1 ампициллин) в двух 3 мл LB-среды в пробирках. Пипетка ампициллин (100 мкг мл – 1) из исходного раствора в среду для селекции и инкубировать при 37 ° С в течение 15 часов в качалке инкубаторе при 180 оборотах в минуту. Добавляют 2 мл предварительных культур к двум 200 мл LB-среде, содержащей ампициллин (100 мкг мл -1), в 1 л колбах. Инкубация протекает при температуре 37 ° С и 180 оборотах в минуту. Мониторинг изменений в OD 600 нм после прививки. Когда OD 600 достигает значения между 0,6 сd 0,8 индуцируют экспрессию путем добавления тетрациклин (0,2 мкг мл – 1). Инкубируйте культур в течение 15 ч при температуре 20 ° C и 180 оборотов в минуту. Примечание: Так как OLET Ю.Е. содержит гем кофактор, добавление δ-амино левулиновая кислоты (0,5 мМ) до индукции необходимо , чтобы обеспечить культуру с предшественником синтеза кофактора. лизис клеток Выполните следующие шаги на льду. Передача культуры путем декантации или пипеткой в ​​центрифужные пробирки и использовать шкалу, чтобы обеспечить равномерное распределение. Центрифуга культур в течение 20 мин при 12000 х г при 4 ° С. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют гранул в 50 мл буфера (Трис 50 мМ, NaCl 200 мМ, рН 7,5) с помощью пипетки и переносят подвеску в конической центрифужной пробирке. После центрифугирования в течение 15 мин при 4000 х г при 4 ° С отбросить супернатант, ресуспендируют каждый осадок в 3 мл буферного раствора с помощью пипетки. Выполнение лизиса клеток с помощью такnicating решения на льду (три цикла х 30 сек), оставляя 1 мин пауза в между циклами с. Центрифуга растворы в течение 20 мин при 15000 х г при 4 ° С для удаления остатков клеток и перенести надосадочную жидкость в конической центрифужную пробирку, не нарушая гранул с помощью пипетки. Выбросите осадок. Примечание: Одна фракция растворителя будет использоваться непосредственно для биокатализе после того, как малые молекулы удалены. Вторая фракция будет использоваться для очистки His-меченой Olet JE. Удаление небольших молекул клеточных экстрактов Перед использованием неочищенного экстракта в биокатализе удалить небольшие молекулы, которые могут помешать образованию перекиси водорода или переноса электронов пипеткой 3 мл экстракта бесклеточной в блок центрифуга фильтр с 10 кДа мембрану и центрифуге при 4000 мкг при 4 ° С. Ресуспендируют оставшегося белка в 3 мл трис-HCl-буфера. Очистка Olet </stroнг> Нанесите 3 мл смеси растворителей второго клеточного экстракта Его спиновых колонках пур Ni-NTA, которые уравновешивают до того уравновешивающим буфером (трис 20 мМ, NaCl 300 мМ, 10 мМ имидазола). Уплотнение колонны с нижним вилок и верхними винтовыми колпачками и трясти их слегка, пока смола не распределяется равномерно с бесклеточной экстракта. Выдержите Загруженные колонки в течение 30 мин в воздушной шейкере при температуре 4 ° С. Вымойте колонки с 1 мл промывочного буфера (Трис 20 мМ, NaCl 300 мМ, 20 мМ имидазола, рН 7,4) путем центрифугирования при 700 мкг в течение 2 мин. Повторите этот шаг дважды. Поместите колонки в новую коническую центрифужную пробирку и добавляют 1 мл элюирующего буфера (Трис 20 мМ, NaCl 300 мМ, 250 мМ имидазола, рН 7,4) Olet JE. Центрифуга при 700 мкг в течение 2 мин и повторить этот шаг в два раза. Примечание: имидазола будет связываться с никелем и таким образом удалить Olet JE из колонки. Трансфер вымывание в блок центрифуг фильтра (10 кДа MEMбрана) и центрифуге при 4000 х г при 4 ° С для удаления имидазола. Проверьте чистоту фермента с помощью SDS-PAGE (15%). 9 Смесь 3 мкл элюирования с SDS-буфером (конечная концентрация 1 раз) и инкубировать раствор при 95 ° С в течение 5 мин для денатурации. Впоследствии применять общую сумму на ДСН-ПААГ. Выполнить гель при 35 мА, используя коммерческий стандарт белка. Обнаружение белка в 50 кДа. Для определения концентрации белка используют коммерчески доступный бычий сывороточный альбумин-набора. 50 мкл разбавленных образцов белка (1: 100, 1: 200, 1: 500) и стандартный БСА (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 мг мл – 1) в 96-луночный планшет , Добавить 200 мкл реагента Брэдфорда, измеряют оптическую плотность при длине волны 595 нм через 15 мин с флуориметре и расчета концентрации с использованием стандартной кривой. 2. Свет катализируемой Биотрансформация Биокаталитические реакции без добавления перекиси водорода Приготовьте 10 мл исходного раствора 10 мМ стеариновой кислоты (М г 284,5 г моль -1) добавлением 10% (об / об) Tergitol и 0,0284 г стеариновой кислоты в дистиллированной воде. Раствор нагревают в камере для нагрева до 60 ° С до тех пор, жирная кислота полностью не растворится. Биокатализ и отбор проб Приготовьте два 2 мл реакционных смесей, содержащих 50 мМ ЭДТА, 0,01 мМ FMN, 0,5 мМ стеариновой кислоты в Трис-HCl-буфере. Добавьте магнитной мешалкой в ​​течение достаточного подачи кислорода и помещают стеклянные трубки в ванну с водой, нагревают до 25 ° C. Добавить 200 мкг мл -1 очищенного фермента или 10% (об / об) клеток экстракт для каждой из реакционных смесей и освещают их с прозрачной стеклянной лампы (120 Вт) в расстоянии 15 см от реакционных труб. Взять 200 мкл образцов в определенные моменты времени (0, 10, 30, 60 и 120 мин и в течение ночи) прекращени реакции с 20 мкл 37% -ной HCl. Добавьте 5 мкл миристиновой кислоты (10 мМ маточного таклюция) в качестве внутреннего стандарта. Анализ продуктов реакции Для экстракции добавляют 500 мкл этилацетата к образцам дважды, инвертировать пробирки и центрифугируют в течение 1 мин при 13000 х г. Взлет 400 мкл надосадочной жидкости и дайте растворитель полностью испарится. Дериватизации карбоновых кислот в trimethylsilylcarboxylic кислоты путем добавления 200 мкл N – метил – N – (триметилсилил) ацетамид трифтор (MSTFA). Выдержите раствор при 60 ° С в течение 30 мин с целью превращения гидроксильных групп в триметилсилил эфиров. Определение конверсии с помощью GC / FID Примечание: Определить, образование 1-гептадецен (RT: 8.34 мин), α- и β-гидрокси стеариновой кислоты (RT: 12,05 и 12,1 мин) и уменьшение субстрата (RT: 11,15 мин) с помощью GC / FID. Установите температурный профиль, описанный ниже заданной температуры впрыска до 340 ° C. Держатьначальная температура печи при 90 ° С в течение 3,5 мин , а затем возрастает с 45 ° C мин -1. При температуре 220 ° С, поддерживать температуру в течение 2 мин. После повторного увеличения до 45 ° С мин -1, поддерживать температуру при 280 ° С в течение 2 мин , а затем возрастает с 60 ° С мин -1. ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная температура 330 ° С выдерживают в течение 1,44 мин. Вводят 4 мкл образца, с отношением разделенного 5, чтобы получить быстрое улетучивание и гомогенное перемешивание с носителем газа гелия. Примечание: В зависимости от повышения температуры подложки и продукты поступают в газовую фазу. Вещества, детектируются GC детектором / FID после прохождения колонки в определенное время удерживания и отображаются в виде пиков на экране. Обратите внимание на формирование пика на мониторе. Вычислить концентрацию образованного продукта по следующей формуле: <img alt="Уравнение 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> Примечание: коэффициент калибровки определен специально для этой колонки для каждого субстрата и продукта путем расчета стандартной кривой от известных количеств дериватизированная веществ и их соответствующей площади пика. Определение пиков олефинов и бета-гидрокси кислоты с помощью ГХ / МС. Определение пиков олефинов и бета-гидрокси кислоты с помощью ГХ / МС. Установить температурный профиль. Установите температуру впрыска до 250 ° С. Держа температуру печи при 100 ° С в течение 5 мин , а затем возрастает с 20 ° C мин -1. Примечание: Максимальная температура держится в течение 7,5 мин. Установите температуру детектора масс-спектрометра до 250 ° C и при сканировании от 50 до 500 м / г в режиме электронного удара. Примечание: ударная ионизация Electron удаляет один электрон, что приводит к образованию катион-радикала, который будет передан вперед для масс-спектрального анализа. Из-за высоких intramolar энергии ковалентных связей в рамкахМолекула перерыв создания фрагментов нижней т / г. Эти фрагменты образуют отпечаток пальца специфическую для вещества. Вводят 1 мкл образца. Обнаружение 1-гептадецен после 11,4 мин времени удерживания с помощью соответствующего отпечатка пальца (рисунок 2).