Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. ve bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çeşitli akut olarak toksik ve kanserojen. zararlı organik çözücüler, özellikle reaksiyon ürünlerinin çıkarma ve yağ asitlerinin türetme içeren tüm basamaklar kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, kapalı-toe ayakkabıları kullanarak davlumbaz altında yapılmalıdır ). Bu çalışmada genetiği değiştirilmiş organizmalar içeren tüm işlemler emniyet seviyesi S1 genetiği değiştirilmiş organizmaların işlenmesi için onaylanan tesisler gerektirir. E. Rekombinant Dekarboksilaz olet JE 1. Ekspresyon E. coli Üretim suşunun hazırlanması Jeotgalicoccus gelen Olet JE bir sentetik gen hazırlamak ve sentezleme vektörü pASK-IBA37plus tarif edildiği gibi klonlanmıştır. 8 </sup> NOT: bakteriyel metabolizma, E. enzimlerle yağlı asitlerin bozulmasını önlemek için, yağ asidi bozulması için işlevsiz yolun ile Keio koleksiyonundan coli suşu JW5020 kullanıldı. Yetiştirme ve enzim ekspresyonunun indüklenmesi E. aşılayarak bir ön kültür hazırlayın Test tüpleri iki 3 mi LB-ortamı içinde (100 ug ml -1 ampisilin ihtiva eden) LB-plaka coli JW5020 olet mutantı. Seçim aracı madde içine bir stok çözeltiden Pipet ampisilin (100 ug ml-1) ve 180 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe 15 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 1 L'lik çalkalama şişelerinde, iki adet 200 ml'lik LB-ortamı içeren, ampisilin (100 | ig mi-1) ön kültürler 2 ml ilave edilir. Kuluçka 37 ° C'de ve 180 rpm'de devam eder. OD 600Nm değişikliği Monitör aşılamadan sonra. OD 600 0.6 Bir arasında bir değere ulaştığındad 0.8 (0.2 ug ml -1) tetrasiklin ekleyerek ifadesini teşvik eder. 20 ° C'de 15 saat ve 180 rpm'de kültürlerin inkübe edin. Not: Olet JE bir hem kofaktör içerdiği, δ-amino levülinik asit (0.5 mM) uyarmadan önce eklenmesi kofaktör sentezi için bir prekürsör ile kültür sağlamak için gereklidir. Hücre liziz buz üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. santrifüj tüplerine içine şişeden veya pipetleme kültürleri aktarın ve eşit dağılımını sağlamak için bir ölçek kullanın. 4 ° C'de 12,000 x g'de 20 dakika boyunca kültürler santrifüj. Dikkatle süpernatan atılır ve pipetleme 50 ml kadar tampon (50 mM Tris, 200 mM NaCI, pH 7.5) içinde tekrar süspansiyon pelet ve bir konik santrifüj tüpüne süspansiyon aktarın. 4 ° C'de 4,000 x g'de 15 dakika santrifüje tabi tutulduktan sonra, süpernatant atın pipetleme 3 mi tampon maddesi içinde, her pelletini. böylece hücre lizis gerçekleştirinçevrimleri arasında 1 dakika bekleme süresi ayrılan buz üzerinde çözümler (x 30 saniye üç döngü) kurmanın. Santrifüj, 4 ° C'de 15,000 x g'de 20 dakika boyunca çözeltiler hücre debrisini uzaklaştırmak ve pipetleme pelet bozmadan konik santrifüj tüpü içine süpernatant aktarmak için kullanılır. pelet atın. Not: küçük moleküller çıkarıldıktan sonra bir çözücü madde fraksiyon biyokataliz için doğrudan kullanılır. İkinci fraksiyon His ile etiketlenmiş olet JE saflaştırılması için kullanılacaktır. Hücre ekstrelerinin küçük moleküllerin uzaklaştırılması biyokataliz ham ekstre, 4 ° C'de 4,000 x g'de 10 kDa'lık bir membran ve santrifüj ile santrifüj filtre ünitesine hücresi serbest özütü 3 ml pipetleme hidrojen peroksit oluşumu ya da elektron transfer etkileşebilir küçük molekülleri kaldırma kullanmadan önce. 3 ml Tris-HCl-tamponu içinde geri kalan protein süspanse edin. Olet saflaştırılması </strong> dengeleme tamponu (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 10 mM) ile daha önce dengelenmiş olan His Pur Ni-NTA döner gruplarından ikinci hücre ekstresi 3 ml uygulanır. alt fişler ve üst vida kapaklarla sütunlar Seal ve reçine hücre içermeyen ekstresi ile eşit olarak dağıtılır kadar hafifçe sallayın. 4 ° C de bir üst çalkalayıcıda 30 dakika için yerleştirilmiştir sütun inkübe edin. 2 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yıkama tamponu 1 ml (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 20 mM, pH 7.4) ile sütun yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. Taze konik santrifüj tüpü içine sütun yerleştirin ve elüsyon tamponu 1 ml (Tris, 20 mM NaCl, 300 mM imidazol, 250 mM, pH 7.4) olet JE ekleyin. 2 dakika süreyle 700 xg'de Santrifüj ve bu adımı iki kez tekrarlayın. NOT: imidazol nikel bağlanır ve böylece sütundan olet JE kaldıracaktır. Bir santrifüj filtre ünitesine elüsyon aktarın (10 kDa memmembran) ve 4 ° C'de 4000 x g'de santrifüj tuzdan arındırılır. Bir SDS-PAGE (% 15). 9 karışımı SDS-tamponu (nihai konsantrasyon 1 x) ile elüsyon için 3 ul enzimin saflığı kontrol ve denatürasyon için 5 dakika boyunca 95 ° C'da, çözelti inkübe edin. Daha sonra bir SDS-Page toplam miktarda uygulayın. ticari bir protein standardı kullanılarak 35 mA jel çalıştırın. 50 kDa protein algılar. Protein konsantrasyonu ticari mevcut BSA-kit kullanmak belirlemek. Pipet seyreltildi protein örneklerinin 50 ul (1: 100, 1: 200, 1: 500) ve BSA standardına (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg mi-1), 96 oyuklu bir plaka içerisinde . Bradford reaktifi 200 ul ekleyin bir florimetrede ile 15 dakika sonra 595 nm'de absorbansı ölçmek ve standart eğri kullanılarak konsantrasyonları hesaplayın. 2. Işık katalize Biyotransformasyon Hidrojen peroksit ilave edilmeden Biyokatalitik reaksiyonlar Damıtılmış su% 10 (h / h) Tergitol ve 0,0284 g stearik asit eklenerek 10 mM stearik asit (M R 284.5 g mol-1) 'in bir 10 ml stok çözelti hazırlayın. yağlı asit tamamen eriyene kadar 60 ° C'ye kadar bir ısıtma odası içinde çözelti ısıtılır. Biyokataliz ve örnekleme 50 mM EDTA, 0.01 mM FMN, Tris-HCI tampon içinde 0.5 mM stearik asit ihtiva eden iki adet 2 ml reaksiyon karışımları hazırlayın. oksijen beslemesi için bir manyetik karıştırma çubuğu ilave edin ve 25 ° C'ye kadar ısıtıldı, bir su banyosu içinde, cam tüpler, yerleştirin. Reaksiyon karışımlarının her birine saflaştınlmış enzim, 200 ug ml-1 veya% 10 (h / h) hücresi serbest özütü ilave edin ve reaksiyonu tüpler 15 cm uzakta bir açık cam ampul (120 W) ile aydınlatır. 20 ul% 37 HCI ile reaksiyon durdurularak belirli zaman noktalarında (0, 10, 30, 60 ve 120 dakika ve gece boyunca) 200 ul numune alın. 5 ul miristik asit ekleyin (10 mM stok yaniİç standart olarak dökülmesinden). Reaksiyon ürünlerinin analizi Çıkarma için, iki numune, 500 ul etil asetat ilave 13,000 x g'de 1 dakika için tüpler ve santrifüj ters. süpernatant 400 ul çıkarın ve solvent tamamen buharlaşması izin verin. (Trimetilsilil) trifloro asetamid (MSTFA) – 200 ul K-metil-N eklenerek trimethylsilylcarboxylic asit içine karboksilik asitler türetmek. eterler, trimetilsilile hidroksil grupları dönüştürmek için 30 dakika boyunca 60 ° C'da, çözelti inkübe edin. GC / FID ile dönüşüm tayini NOT: / FID GC: substrat: (12.05 ve 12.1 dk RT) ve azalma, α- ve β-hidroksi stearik asit (11.15 dk RT): 1-heptadekenin (8.34 dk RT) oluşumunu belirler. 340 ° C'ye kadar Set altında enjeksiyon sıcaklığı açıklanan sıcaklık profilini ayarlayın. AmbarBaşlangıç ​​fırın sıcaklığı 3.5 dakika boyunca 90 ° C'de ve daha sonra 45 ° C dk-1 ile birlikte artar. 220 ° C 'de, 2 dakika süreyle sıcaklık tutun. 45 ° C min -1 bir tekrarlanan artıştan sonra, 2 dakika süreyle 280 ° C sıcaklık tutun ve sonra min -1 60 ° C artar. NOT: 330 ° C maksimum sıcaklık 1.44 dakika tutulur. Taşıyıcı gaz: Helyum hızlı bir buharlaşmasını ve homojen bir karışım elde etmek için bir 5 bölme oranı ile, örnek 4 ul enjekte edilir. NOT: artan sıcaklığa bağımlılığı ise substrat ve ürünler gaz aşamasına girecektir. maddeler belirli bir bekleme süreleri de sütun geçtikten sonra GC / FID detektörü ile tespit edilir ve ekranda tepe değerleri halinde gösterildi. monitörde zirve oluşumunu gözlemlemek. aşağıdaki formül ile oluşan ürün konsantrasyonu hesaplanır: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> Not: kalibrasyon faktörü türetilmiş maddeler ve bunlara karşılık gelen pik alanı, bilinen miktarlarda standart eğri hesaplama her bir alt-tabaka ve ürün bu sütun için özel olarak tespit edilmiştir. GC / MS ile olefin ve β-hidroksi asit doruklarına belirleyin. GC / MS ile olefin ve β-hidroksi asit doruklarına belirleyin. sıcaklık profilini ayarlayın. 250 ° C'ye enjeksiyon sıcaklığını ayarlamak. 5 dakika boyunca 100 ° C de fırın sıcaklığı tutun ve daha sonra, 20 ° C dk-1 ile birlikte artar. NOT: Maksimum sıcaklık 7.5 dakika tutulur. 250 ° C'ye kadar kütle spektrometresi dedektör sıcaklığını ayarlamak ve elektron darbe modunda 50 500 m / z tarama. Not: Elektron darbeli iyonizasyon kütle analizi ileri geçilecek bir kök katyonu oluşumu ile sonuçlanan tek bir elektron kaldırır. Nedeniyle içindeki yüksek intramolar enerji kovalent bağ ileAlt m / z fragmanları oluşturarak molekül mola. Bu fragmanlar, bir madde için belirli bir parmak izi oluşturmaktadır. örnek 1 ul enjekte edilir. Karşılık gelen parmak izi (Şekil 2) ile 11.4 dakika tutma süresinden sonra 1-heptadekenin algılar.