Lichtgetriebene enzymatische Decarboxylierung

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind akut toxisch und krebserregend. Alle Schritte schädlichen organischen Lösungsmitteln beteiligt, insbesondere die Extraktion der Reaktionsprodukte und die Derivatisierung von Fettsäuren müssen mit persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe unter einem Abzug durchgeführt werden ). Alle Transaktionen im Zusammenhang mit gentechnisch veränderten Organismen in dieser Arbeit erfordern Anlagen, die für den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen der Sicherheitsstufe S1 zugelassen sind. 1. Expression des rekombinanten Decarboxylase OLET JE in E. coli Vorbereitung des Produktionsstammes Vorbereiten eines synthetischen Gens von OLET JE aus Jeotgalicoccus und kloniert in den Expressionsvektor pASK-IBA37plus wie beschrieben. 8 </sup> ANMERKUNG: Um den Abbau von Fettsäuren durch Enzyme , die aus den bakteriellen Stoffwechsel vermeiden, E. coli – Stamm JW5020 von der Keio – Sammlung mit einer dysfunktionalen Weg für den Abbau Fettsäure verwendet wurde. Der Anbau und die Induktion der Enzymexpression Bereiten Sie eine Vorkultur von der E. Impfen coli JW5020 OLET Mutante von einer LB-Platte (mit 100 ug ml -1 Ampicillin) in zwei 3 ml LB-Medium in Reagenzgläser. Pipette Ampicillin (100 ug ml – 1) aus einer Stammlösung in das Medium für die Selektion und inkubieren bei 37 ° C für 15 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 180 UpM. 2 ml der Vorkulturen auf zwei 200 ml LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 ug ml – 1), in 1 l Schüttelkolben. Inkubation schreitet bei 37 ° C und 180 rpm. Überwachen Sie die Änderung in der OD 600nm nach der Inokulation. Wenn die OD 600 erreicht einen Wert zwischen 0,6 eind 0,8 induzieren die Expression von Tetracyclin Zugabe (0,2 ug ml -1). Inkubieren der Kulturen 15 Stunden lang bei 20 ° C und 180 rpm. HINWEIS: Da OLET JE einen Häm – Cofaktor enthält, Zugabe von δ-Aminolävulinsäure (0,5 mM) vor der Induktion benötigt wird, die Kultur mit einem Vorläufer für die Cofaktor – Synthese bereitzustellen. Zelllyse Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis. Übertragen Sie die Kulturen durch Abgießen oder Pipettieren in Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine Skala gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Zentrifugation der Kulturen für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. Sorgfältig den Überstand verworfen und die Pellets in 50 ml Puffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) durch Pipettieren resuspendieren und die Suspension in einem konischen Zentrifugenröhrchen übertragen. Nach Zentrifugation für 15 min bei 4.000 × g bei 4 ° C Überstand verwerfen, jedes Pellet in 3 ml Puffer durch Pipettieren resuspendieren. Führen Sie die Zelllyse durch sokation, die Lösungen auf Eis (drei Zyklen x 30 sec) eine 1 Minute Pause zwischen den Zyklen zu verlassen. Zentrifuge die Lösungen für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen, und der Überstand in ein konisches Zentrifugenröhrchen übertragen, ohne das Pellet durch Pipettieren zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. HINWEIS: Ein Lösungsmittelanteil wird direkt für die Biokatalyse verwendet werden, nachdem kleine Moleküle entfernt werden. Die zweite Fraktion wird zur Reinigung des His-tagged OLET JE verwendet werden. Entfernung von kleinen Molekülen von Zellextrakten Vor der Verwendung der Rohextrakt in Biokatalyse kleine Moleküle zu entfernen, die mit Wasserstoffperoxid-Bildung oder Elektronenübertragung stören könnten durch Pipettieren von 3 ml zellfreien Extrakts in ein Zentrifugenfiltereinheit mit einer 10 kDa Membran und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C. Resuspendieren verbleibende Protein in 3 ml Tris-HCl-Puffer. Reinigung von OLET </strong> Anwenden 3 ml der zweiten Zellextrakt His Pur Ni-NTA Spin-Säulen, die vorher mit Äquilibrierungspuffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) equilibriert wurden. Verschließen Sie die Spalten mit den unteren Stopfen und oberen Schraubverschlüsse und schütteln Sie sie leicht, bis das Harz verteilt ist ebenso mit dem zellfreien Extrakt. Inkubiere die geladenen Spalten für 30 min in einem Überkopfschüttler bei 4 ° C. Waschen der Säulen mit 1 ml Waschpuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 20 mM Imidazol, pH 7,4) von bei 700 × g für 2 min zentrifugiert. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Legen Sie die Spalten in eine frische konische Zentrifugenröhrchen und 1 ml Elutionspuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Zentrifuge bei 700 xg für 2 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. HINWEIS: Imidazole an Nickel binden und somit OLET JE aus der Säule zu entfernen. Übertragen Sie die Elution in ein Zentrifugenfiltereinheit (10 kDa membran) und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C Imidazol zu entfernen. Überprüfen Sie die Reinheit des Enzyms durch eine SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 ul der Elution mit einem SDS-Puffer (Endkonzentration 1x) und Inkubieren der Lösung bei 95 ° C für 5 Minuten zur Denaturierung. Anschließend gelten die Gesamtmenge auf einem SDS-PAGE. Führen Sie das Gel bei 35 mA Kommerzielle Protein-Standard. Erkennt das Protein bei 50 kDa. die Proteinkonzentration verwenden, um einen kommerziell erhältlichen BSA-Kit zu bestimmen. Pipettieren von 50 & mgr; l des verdünnten Proteinproben (1: 100, 1: 200, 1: 500) und BSA – Standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in einer 96-Well – Platte . In 200 ul Bradford-Reagenz, messen die Absorption bei 595 nm nach 15 Minuten mit einem Fluorimeter und berechnen die Konzentrationen der Standardkurve. 2. Licht-katalysierte Biotransformation Biokatalytischen Reaktionen ohne Wasserstoffperoxid zusätzlich Bereiten Sie eine 10 ml Stammlösung von 10 mM Stearinsäure (M r 284,5 g mol -1) durch Zugabe von 10% (v / v) Tergitol und 0,0284 g Stearinsäure zu destilliertem Wasser. Die Lösung wird in einer Heizkammer auf 60 ° C bis die Fettsäure vollständig gelöst ist. Biokatalyse und Probenahme Bereiten zwei 2 ml Reaktionsmischungen enthaltend 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM Stearinsäure in Tris-HCl-Puffer. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab für eine ausreichende Sauerstoffversorgung und legen Sie die Glasrohre in einem Wasserbad erhitzt auf 25 ° C. In 200 ug ml -1 von gereinigtem Enzym oder 10% (v / v) zellfreien Extrakt zu jedem der Reaktionsgemische und beleuchten sie mit einem klaren Glas Glühbirne (120 W) in 15 cm Abstand der Reaktionsrohre. Nehmen Sie 200 ul-Proben zu bestimmten Zeitpunkten (0, 10, 30, 60 und 120 min und über Nacht) Stoppen der Reaktion mit 20 & mgr; l 37% HCl. In 5 ul Myristinsäure (10 mM Lager, solution) als interner Standard. Analyse der Reaktionsprodukte Für die Extraktion 500 ul Ethylacetat zu den Proben zweimal hinzufügen, kehren die Rohre und Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g. Nehmen Sie 400 ul des Überstandes und lassen Sie das Lösungsmittel vollständig verdampfen. Derivatisierung der Carbonsäuren in trimethylsilylcarboxylic Säure durch Zugabe von 200 & mgr; l N – Methyl – N – (trimethylsilyl) acetamid Trifluor (MSTFA). Inkubieren der Lösung bei 60 ° C für 30 min, um Hydroxylgruppen zu konvertieren Ethern Trimethylsilyl. Bestimmung der Umwandlung durch GC / FID HINWEIS: Bestimmen der Bildung von 1-Heptadecen (RT: 8,34 min), α- und β-Hydroxystearinsäure (RT: 12,05 und 12,1 min) und die Abnahme des Substrats (RT: 11,15 min) unter Verwendung von GC / FID. Stellen Sie das Temperaturprofil unter Set die Einspritztemperatur auf 340 ° C beschrieben. Haltendie anfängliche Ofentemperatur bei 90 ° C für 3,5 min und anschließend mit 45 ° C min -1 erhöhen. Bei 220 ° C, halten Sie die Temperatur für 2 min. Nach einer wiederholten Anstieg von 45 ° C min -1, für 2 min die Temperatur auf 280 ° C zu halten und dann mit 60 ° C min -1 erhöht. HINWEIS: Die maximale Temperatur von 330 ° C für 1,44 min gehalten. Injizieren 4 & mgr; l der Probe, mit einem Teilungsverhältnis von 5 schnelle Verflüchtigung und homogene Vermischung mit dem Trägergas Helium zu erhalten. HINWEIS: In Abhängigkeit von der das Substrat und Produkte geben Sie die Gasphase steigender Temperatur. Die Substanzen werden durch das GC / FID-Detektor detektiert, nachdem die Säule an bestimmten Retentionszeiten vorbei und werden als Spitzen auf dem Bildschirm angezeigt. Beachten Sie die Spitzenbildung auf dem Monitor. Berechnen der Konzentration des gebildeten Produkts mit der folgenden Formel: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> HINWEIS: Der Kalibrierungsfaktor durch Berechnung der Standardkurve, die speziell für diese Spalte für jedes Substrat und Produkt aus bekannten Mengen der derivatisierten Substanzen und ihrer entsprechenden Peakfläche bestimmt wurde. Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. Stellen Sie das Temperaturprofil. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 250 ° C. Halten Sie die Ofentemperatur auf 100 ° C für 5 min und anschließend mit 20 ° C min -1 erhöhen. HINWEIS: Die maximale Temperatur wird für 7,5 min gehalten. Stellen Sie das Massenspektrometer Detektortemperatur auf 250 ° C und Scan bei 50 bis 500 m / z in Elektronenstoßmodus. HINWEIS: Elektronenstoß-Ionisation entfernt ein einzelnes Elektron, was zur Bildung eines Radikalkations, die für die Massenanalyse weitergeleitet Vorwärts wird. Aufgrund der hohen intramolar Energie kovalente Bindungen innerhalb derMolekül Bruchfragmente niedriger m / z zu schaffen. Diese Fragmente bilden einen Fingerabdruck spezifisch für eine Substanz ist. Injizieren 1 & mgr; l der Probe. Erfassen 1-Heptadecen nach 11,4 min Retentionszeit durch den entsprechenden Fingerabdruck (Abbildung 2).