Lumière-driven Enzymatic décarboxylation

Attention: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont extrêmement toxiques et cancérigènes. Toutes les étapes impliquant des solvants organiques nocives, en particulier l'extraction des produits de réaction et la dérivation d'acides gras doivent être effectuées sous une hotte en utilisant un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon pleine longueur, des chaussures fermées ). Toutes les opérations impliquant des organismes génétiquement modifiés dans ce travail exigent des installations qui sont approuvés pour le traitement d'organismes génétiquement modifiés du S1 au niveau de la sécurité. 1. Expression du recombinant décarboxylase olet JE dans E. coli Préparation de la souche de production Préparer un gène de synthèse de olet de JE Jeotgalicoccus et clone dans le vecteur d'expression pASK-IBA37plus comme décrit. 8 </sup> REMARQUE: Pour éviter la dégradation des acides gras par les enzymes du métabolisme bactérien, E. coli , la souche de la collection JW5020 Keio avec une voie de dysfonctionnement de la dégradation des acides gras a été utilisé. La culture et l' induction de l' expression enzymatique Préparer un pré-culture en inoculant le E. coli JW5020 olet mutant d'un LB-plaque (contenant 100 pg ml -1 ampicilline) en deux 3 ml de milieu LB dans des tubes à essai. Pipette ampicilline (100 pg ml -1) à partir d' une solution mère dans le milieu de sélection et incuber à 37 ° C pendant 15 heures dans un incubateur à agitation à 180 tours par minute. Ajouter 2 ml de pré-cultures à deux 200 ml de milieu LB, contenant de l' ampicilline (100 pg ml -1), dans 1 L secouer les flacons. L'incubation se déroule à 37 ° C et à 180 tours par minute. Surveiller le changement de OD 600nm après l'inoculation. Lorsque l'OD 600 atteint une valeur comprise entre 0,6 und 0,8 induire l'expression en ajoutant la tétracycline (0,2 pg ml -1). Incuber les cultures pendant 15 heures à 20 ° C et à 180 tours par minute. NOTE: Depuis olet JE contient un cofacteur hème, addition d'acide lévulinique δ-amino (0,5 mM) avant l'induction est nécessaire pour fournir la culture avec un précurseur de la synthèse du cofacteur. lyse cellulaire Effectuez les étapes suivantes sur la glace. Transférer les cultures par décantation ou pipetage dans des tubes de centrifugation et utiliser une échelle pour assurer une distribution égale. Centrifuger les cultures pendant 20 minutes à 12.000 xg à 4 ° C. se débarrasser soigneusement le surnageant et remettre en suspension les culots dans 50 ml de tampon (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) par pipetage et transférer la suspension dans un tube centrifuge conique. Après centrifugation pendant 15 min à 4000 g à 4 ° C, éliminer le surnageant, remettre en suspension chaque culot dans 3 ml de tampon par pipetage. Effectuer la lyse cellulaire par tantnication les solutions sur la glace (trois cycles x 30 sec) en laissant une pause de 1 min entre les cycles. Centrifuger les solutions pendant 20 min à 15 000 xg à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires et le transfert du surnageant dans un tube de centrifugation conique sans perturber le culot par pipetage. Jeter le culot. Remarque: Une fraction de solvant sera utilisée directement pour la biocatalyse après les petites molécules sont enlevées. La seconde fraction est utilisée pour la purification du olet JE marquée par His. Enlèvement de petites molécules de cellules-extraits Avant d'utiliser l'extrait brut en biocatalyse pour éliminer les petites molécules qui pourraient interférer avec la formation de peroxyde d'hydrogène ou un transfert d'électrons par pipetage 3 ml d'extrait acellulaire dans une unité de filtre centrifuge avec une membrane et centrifuger kDa, 10 à 4000 g à 4 ° C. Remettre en suspension la protéine restante dans 3 ml de Tris-HCl tampon. Purification de olet </strong> Appliquer 3 ml du deuxième extrait cellulaire à ses colonnes à centrifuger Pur Ni-NTA, qui ont été équilibrées avant avec un tampon d'équilibrage (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 10 mM). Sceller les colonnes avec les bouchons de fond et capsules à vis supérieures et les secouer légèrement jusqu'à ce que la résine est répartie également avec l'extrait exempt de cellules. Incuber les colonnes chargées pendant 30 min dans un agitateur de tête à 4 ° C. On lave les colonnes avec 1 ml de tampon de lavage (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 20 mM, pH 7,4) par centrifugation à 700 g pendant 2 min. Répéter deux fois cette étape. Placez les colonnes dans un tube de centrifugation conique fraîche et ajouter 1 ml de tampon d'élution (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, pH 7,4) olet JE. Centrifuger à 700 g pendant 2 min et répétez cette étape deux fois. NOTE: Imidazole va se lier au nickel et donc retirer olet JE de la colonne. Transfert de l'élution à une unité de filtre centrifuge (10 kDa membrane) et centrifuger à 4000 g à 4 ° C pour éliminer l'imidazole. Vérifier la pureté de l'enzyme par une SDS-PAGE (15%). Mélange 9 3 ul de l'élution avec un tampon SDS (concentration finale 1x) et on incube la solution à 95 ° C pendant 5 min pour la dénaturation. appliquer ensuite le montant total sur un SDS-PAGE. Exécutez le gel à 35 mA en utilisant une protéine étalon commercial. Détecter la protéine à 50 kDa. Pour déterminer la concentration en protéines disponibles utilisent un BSA-kit commercial. Pipette 50 ul d'échantillons de protéines dilué (1: 100, 1: 200, 1: 500) et la norme BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) dans une plaque à 96 puits . Ajouter 200 pi de réactif de Bradford, mesurer l'absorbance à 595 nm après 15 min avec un fluorimètre et calculer les concentrations en utilisant la courbe standard. 2. Biotransformation Light-catalysée Les réactions biocatalytiques sans addition de peroxyde d'hydrogène Préparer une solution à 10 ml de bouillon de 10 mM d'acide stéarique (M r 284,5 g mol -1) en ajoutant 10% (v / v) tergitol et 0,0284 g d' acide stéarique à l' eau distillée. Chauffer la solution dans une chambre de chauffage à 60 ° C jusqu'à ce que l'acide gras est complètement dissous. Biocatalyse et d' échantillonnage Préparer deux 2 ml de mélanges réactionnels contenant 50 mM d'EDTA, 0,01 mM de FMN, l'acide stéarique 0,5 mM dans du Tris-HCl tampon. Ajouter une barre d'agitation magnétique pour l'alimentation en oxygène suffisante et placer les tubes de verre dans un bain d'eau chauffée à 25 ° C. Ajouter 200 pg ml -1 d'enzyme purifiée ou 10% (v / v) d' extrait exempt de cellules à chacun des mélanges réactionnels et les éclairer avec une ampoule de verre transparent (120 W) à 15 cm de distance des tubes de réaction. Prendre des échantillons de 200 ul à des points temporels spécifiques (0, 10, 30, 60 et 120 min et pendant la nuit) à arrêter la réaction avec 20 ul de HCl à 37%. Ajouter 5 ul d'acide myristique (10 mM afinrésolu-) comme standard interne. L' analyse des produits de réaction Pour l'extraction ajouter de l'acétate d'éthyle, 500 ul des échantillons deux fois, inverser les tubes et centrifuger pendant 1 min à 13 000 x g. Enlever 400 pi du surnageant et laisser le solvant évaporer complètement. Dérivatiser les acides carboxyliques en acide trimethylsilylcarboxylic en ajoutant 200 pi de N -méthyl- N – (triméthylsilyl) trifluoro acétamide (MSTFA). Incuber la solution à 60 ° C pendant 30 minutes afin de convertir les groupes hydroxyles en triméthylsilyléthers. Détermination de la conversion par GC / FID REMARQUE: déterminer la formation de 1-heptadécène (TR: 8,34 min), l'acide stéarique, α- et β-hydroxy (RT: 12,05 et 12,1 min) et la diminution du substrat (RT: 11,15 min) en utilisant GC / FID. Définissez le profil de température décrit ci-dessous Régler la température d'injection à 340 ° C. Tenirla température initiale du four est à 90 ° C pendant 3,5 min , et augmente ensuite à 45 ° C min -1. A 220 ° C, maintenir la température pendant 2 min. Après une augmentation répétée de 45 ° C min -1, maintenir la température à 280 ° C pendant 2 min, puis augmenter avec 60 ° C min -1. NOTE: La température maximale de 330 ° C est maintenue pendant 1,44 min. Injecter 4 ul de l'échantillon, avec un rapport de division de 5 pour obtenir une volatilisation rapide et un mélange homogène avec de l'hélium gazeux porteur. Remarque: en fonction de l'augmentation de la température du substrat et des produits entreront dans la phase gazeuse. Les substances sont détectées par le GC / détecteur FID après le passage de la colonne à des temps de rétention spécifiques et sont affichés sous forme de pics à l'écran. Observer la formation de pointe sur le moniteur. Calculer la concentration du produit formé par la formule suivante: <img alt="L'équation 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> NOTE: Le facteur d'étalonnage a été déterminée spécifiquement pour cette colonne pour chaque substrat et le produit en calculant la courbe standard à partir de quantités connues des substances dérivées et leur zone de pic correspondant. Identifier les pics d'acides oléfiniques et ß-hydroxy par GC / MS. Identifier les pics d'acides oléfiniques et ß-hydroxy par GC / MS. Définissez le profil de température. Réglez la température d'injection à 250 ° C. Maintenir la température du four à 100 ° C pendant 5 min et ensuite augmenter à 20 ° C min -1. NOTE: Maximum température est maintenue pendant 7,5 min. Régler la température du détecteur de spectrométrie de masse à 250 ° C et de numérisation de 50 à 500 m / z en mode d'impact d'électrons. REMARQUE: ionisation par impact électronique supprime un seul électron qui entraîne la formation d'un radical cation qui sera transmis vers l'avant pour une analyse de masse. En raison des liaisons covalentes énergétiques élevées dans le intramolarbreak molécule création de fragments de bas m / z. Ces fragments forment une empreinte spécifique pour une substance. Injecter 1 pl de l'échantillon. Détecter le 1-heptadécène après 11,4 min Temps de rétention par l'empreinte correspondante (figure 2).