Light-driven Enzymatische Decarboxylatie

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Verscheidene van de chemicaliën die in deze syntheses zijn acuut giftig en carcinogeen. Alle stappen met betrekking tot schadelijke organische oplosmiddelen, in het bijzonder de extractie van de reactieproducten en de derivatisering van vetzuren moet plaatsvinden onder een zuurkast worden uitgevoerd met behulp van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, full-length broek, dichte schoenen ). Alle handelingen met genetisch gemodificeerde organismen in dit werk vereisen installaties die zijn goedgekeurd voor de behandeling van genetisch gemodificeerde organismen van het veiligheidsniveau S1. 1. expressie van het recombinante Decarboxylase olet JE in E. coli Bereiding van de productiestam Bereid een synthetisch gen olet JE van Jeotgalicoccus en gekloneerd in de expressie vector pASK-IBA37plus beschreven. 8 </sup> OPMERKING: Om de afbraak van vetzuren door enzymen van het metabolisme van bacteriën, E. voorkomen coli stam JW5020 uit de Keio collectie met een disfunctioneel route voor vetzuur afbraak werd gebruikt. Teelt en inductie van enzym expressie Bereid een pre-cultuur door het enten van de E. coli JW5020 Olet mutant uit een LB-plaat (met 100 ug ml -1 ampicilline) in twee 3 ml LB-medium in reageerbuizen. Pipet ampicilline (100 ug ml-1) uit een voorraadoplossing in het medium voor selectie en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 uur in een schudincubator bij 180 rpm. Voeg 2 ml van de pre-kweken twee 200 ml LB-medium dat ampicilline (100 ug ml-1), in 1 L schudflessen. Incubatie verloopt bij 37 ° C en 180 rpm. Bewaken van de verandering in de OD 600 nm na de inoculatie. Toen de OD 600 een waarde tussen 0,6 een bereiktd 0,8 induceren de expressie door toevoeging van tetracycline (0,2 ug ml-1). Incubeer de kweken gedurende 15 uur bij 20 ° C en 180 rpm. OPMERKING: Aangezien olet JE bevat een heem cofactor, is toevoeging van δ-amino levulinezuur (0,5 mM) vóór inductie nodig om de kweek te voorzien van een precursor voor de synthese cofactor. cellysis Voer de volgende stappen op het ijs. Breng de culturen door decanteren of pipetteren in centrifugebuizen en gebruik maken van een schaal om gelijke verdeling te garanderen. Centrifugeer de kweken gedurende 20 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellets in 50 ml buffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) door pipetteren en breng de suspensie in een conische centrifugebuis. Na centrifugatie gedurende 15 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C gooi het supernatant, resuspendeer elke pellet in 3 ml buffer door pipetteren. Voer cellysis door zoniceren de oplossingen op ijs (drie cycli x 30 sec) waardoor een 1 min pauze tussen de cycli. Centrifugeer de oplossing gedurende 20 min bij 15.000 xg bij 4 ° C om celresten te verwijderen en breng het supernatans in een conische centrifugebuis zonder de pellet te verstoren door pipetteren. Gooi de pellet. LET OP: Een oplosmiddel fractie zal rechtstreeks worden gebruikt voor biokatalyse na kleine moleculen worden verwijderd. De tweede fractie wordt gebruikt voor de zuivering van de His-tag olet JE. Verwijderen van kleine moleculen van cel- extracten Alvorens het ruwe extract in biokatalyse verwijderen kleine moleculen storende vorming van waterstofperoxide of elektronenoverdracht pipetteren 3 ml celvrije extract in een centrifuge filter unit met een 10 kDa membraan en centrifugeer bij 4000 xg bij 4 ° C. Resuspendeer de resterende eiwit in 3 ml Tris-HCl-buffer. Zuivering van Olet </strong> Toepassen 3 ml van de tweede celextract Zijn Pur Ni-NTA spin-kolommen, die eerder geëquilibreerd met equilibratiebuffer (20 mM Tris, NaCl 300 mM, 10 mM imidazool). Sluit de kolommen met de onderste pluggen en bovenste schroef-caps en schud ze zachtjes tot het hars gelijkmatig wordt verdeeld met de cel-extract. Incubeer de kolommen geladen voor 30 minuten per overhead schudder bij 4 ° C. Was de kolom met 1 ml wasbuffer (20 mM Tris, NaCl 300 mM, 20 mM imidazool, pH 7,4) door centrifugeren bij 700 g gedurende 2 min. Herhaal deze stap twee keer. Plaats de kolommen in een schoon conische centrifugebuis en voeg 1 ml elutiebuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 250 mM imidazool, pH 7,4) olet JE. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten en herhaal deze stap tweemaal. LET OP: Imidazool zal binden aan nikkel en dus verwijderen olet JE uit de kolom. Breng de elutie een centrifuge filtereenheid (10 kDa membraan) en centrifugeer bij 4000 xg bij 4 ° C verwijderen van imidazol. Controleer de zuiverheid van het enzym door een SDS-PAGE (15%). 9 Meng 3 ul van de elutie met een SDS-buffer (eindconcentratie 1x) en incubeer de oplossing bij 95 ° C gedurende 5 minuten voor denaturatie. Vervolgens toegepast het totale bedrag op een SDS-PAGE. Voer de elektroforese bij 35 mA onder toepassing van een commercieel eiwitstandaard. Detecteren eiwit bij 50 kDa. Het bepalen van de eiwitconcentratie gebruikt een commercieel beschikbare BSA-kit. Pipetteer 50 ul verdunde proteïne monsters (1: 100, 1: 200, 1: 500) en BSA standaard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml-1) in een 96-putjesplaat . Voeg 200 ul van Bradford-reagens, meet de absorptie bij 595 nm na 15 min met een fluorimeter en berekend de gebruikmaking van de standaardkromme. 2. Licht-gekatalyseerde Biotransformatie Biokatalytische reacties zonder waterstofperoxide aanvulling Bereid een 10 ml voorraadoplossing van 10 mM stearinezuur (Mr 284,5 g mol -1) door toevoeging van 10% (v / v) Tergitol en 0,0284 g stearinezuur gedistilleerd water. Verwarm de oplossing in een droogstoof op 60 ° C totdat het vetzuur volledig opgelost. Biokatalyse en bemonstering Bereid twee 2 ml reactiemengsels die 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM stearinezuur in Tris-HCl-buffer. Voeg een magnetische roerstaaf voldoende zuurstoftoevoer en plaats de glazen buizen in een waterbad verwarmd tot 25 ° C. Voeg 200 ug ml-1 gezuiverd enzym of 10% (v / v) celvrij extract aan elk van de reactiemengsels en verlichten ze namelijk glazen lamp (120 W) op 15 cm afstand van de reactiebuizen. Neem 200 ul monsters op specifieke tijdstippen (0, 10, 30, 60 en 120 min en overnacht) stoppen van de reactie met 20 ul 37% HCl. Voeg 5 ul myristinezuur (10 mM voorraad, zodatlutie) als interne standaard. Analyse van de reactieproducten Voor extractie voeg 500 pl ethylacetaat om de monsters tweemaal inverteren en centrifugeer gedurende 1 min bij 13.000 x g. Take off 400 ul van de bovenstaande vloeistof en laat het oplosmiddel helemaal verdampen. Derivatiseren de carbonzuren in trimethylsilylcarboxylic zuur door toevoeging van 200 pl N-methyl-N – (trimethylsilyl) trifluor aceetamide (MSTFA). Incubeer de oplossing bij 60 ° C gedurende 30 min teneinde hydroxylgroepen trimethylsilyl ethers zetten. Bepaling van conversie door GC / FID OPMERKING: Bepaal de vorming van 1-heptadeceen (RT: 8,34 min), α- en β-hydroxystearinezuur (RT: 12,05 en 12,1 min) en afname van het substraat (RT: 11,15 min) met behulp van GC / FID. Stel het temperatuurprofiel onderstaande beschreven de injectietemperatuur tot 340 ° C. Greepde initiële oventemperatuur bij 90 ° C gedurende 3,5 minuten en vervolgens toenemen met 45 ° C min -1. Bij 220 ° C, houd de temperatuur gedurende 2 minuten. Na herhaalde toename van 45 ° C min -1 Houd de temperatuur op 280 ° C gedurende 2 minuten en verhoog met 60 ° C min -1. LET OP: Maximale temperatuur van 330 ° C wordt gehouden voor 1,44 min. Injecteer 4 pl van het monster, met een splitsingsverhouding van 5 tot snelle verdamping en homogeen mengen het dragergas helium krijgen. Opmerking: In afhankelijkheid van de stijgende temperatuur zal het substraat en de producten van de gas- fase. De stoffen worden gedetecteerd door de GC / FID detector na het passeren van de kolom bij specifieke retentietijden en worden als pieken op het scherm. Let op de formatie piek op de monitor. Bereken de concentratie van gevormde product door de volgende formule: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> OPMERKING: De kalibratiefactor is specifiek voor deze kolom voor elk substraat en product door het berekenen van de standaardkromme van bekende hoeveelheden van het gederivatiseerde stoffen en de overeenkomstige piekoppervlak. Identificeer olefine en β-hydroxyzuur pieken met GC / MS. Identificeer olefine en β-hydroxyzuur pieken met GC / MS. Stel de temperatuur profiel. Stel de injectietemperatuur tot 250 ° C. Houd de oventemperatuur bij 100 ° C gedurende 5 min en vervolgens toenemen met 20 ° C min -1. LET OP: Maximale temperatuur wordt gehouden gedurende 7,5 min. Stel de massaspectrometer detector temperatuur tot 250 ° C en scannen 50 tot 500 m / z met elektronimpact modus. OPMERKING: Electron effect ionisatie verwijdert een enkel elektron resulteert in de vorming van een radicaal kation die voorwaarts wordt doorgegeven voor massa-analyse. Door de hoge energie intramolar covalente bindingen binnen demolecule break creëren van fragmenten van lagere m / z. Deze fragmenten vormen een vingerafdruk specifiek voor een stof. Injecteer 1 ul van het monster. Detect 1-heptadeceen na 11,4 min retentietijd de overeenkomstige fingerprint (figuur 2).