光駆動酵素的脱炭酸

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、急性毒性及び発がん性があります。有害な有機溶剤、特に反応生成物の抽出および脂肪酸の誘導体化を含むすべてのステップは、個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣、フルレングスパンツ、閉じたつま先の靴を使用して、ヒュームフードの下で行わなければなりません）。この作業では遺伝子組み換え生物を含むすべての操作は、安全レベルS1の遺伝子組換え生物の取扱いのために承認されたインストールが必要です。 大腸菌における組換えデカルボキシラーゼOLET JEの1式大腸菌 生産菌株の作製 JeotgalicoccusからOLET JEの合成遺伝子を調製し、発現ベクターPASK-IBA37plus記載されているようにクローニングした。8 </sup> 注：細菌代謝の酵素によって脂肪酸の分解を回避するために、E。脂肪酸分解のための機能不全の経路と慶應義塾コレクションからコリ株JW5020を使用しました。 栽培と酵素発現の誘導 E.を接種することにより前培養を準備試験管内の2つの3ミリリットルのLB培地（100μgのml -1のアンピシリンを含む）LB-plateから大腸菌 JW5020 OLET変異体。選択用培地にストック溶液からピペットアンピシリン（100μgのミリリットル-1）、180 rpmで振盪インキュベーター中で15時間37℃でインキュベートします。 1 Lの振とうフラスコに、アンピシリン（100μgのmlに-1）を含む、2 200ミリリットルのLB培地に前培養の2ミリリットルを追加します。インキュベーションは、37℃、180rpmで進行します。 OD 600nmでの変化を監視します 接種後。 OD 600が 0.6の値に達したときD 0.8（0.2μgのミリリットル-1）テトラサイクリンを添加し、発現を誘導します。 20°Cおよび180 rpmで15時間、培養液をインキュベートします。 注：OLET JEは、ヘム補因子を含んでいるので、δアミノレブリン酸（0.5 mM）の誘導前への添加は補因子の合成のための前駆体と文化を提供するために必要とされます。 細胞溶解 氷の上で次の手順を実行します。遠心管にデカントまたはピペッティングによって培養液を移し、平等な分配を確保するために、スケールを使用しています。 4℃で12,000×gで20分間培養液を遠心。 注意深く上清を破棄し、ピペッティングにより50ミリリットルバッファ（50mMトリス、NaClを200 mMの、pHは7.5）にペレットを再懸濁し、コニ​​カル遠心チューブ中の懸濁液を移します。 4℃で4000×gで15分間の遠心分離後、上清を捨てピペッティングにより3ミリリットルバッファ内の各ペレットを再懸濁します。 そうすることにより細胞溶解を行いますサイクルの間に1分間の休止を残して氷の上でソリューション（×30秒3回）を通。遠心分離を4℃で15,000×gで20分間、溶液をピペッティングすることによってペレットを乱すことなく、細胞破片を除去し、コニカル遠心チューブに上清を移します。ペレットを捨てます。 注：小分子が除去された後、一つの溶媒画分を生体触媒に直接使用されます。第二の画分は、HisタグOLET JEの精製に使用されます。 細胞抽出物の小分子の除去 生体触媒で粗抽出物を使用する前に4℃で4000×gで10 kDaの膜と遠心分離機で遠心分離フィルターユニットに無細胞抽出液の3ミリリットルをピペットで過酸化水素形成または電子移動を妨害する可能性がある小分子を除去します。 3ミリリットルのTris-HCl緩衝液の残りのタンパク質を再懸濁します。 OLETの精製 </stroNG> 平衡緩衝液（20mMトリス、NaClを300mMのイミダゾールを10mM）で前平衡化された彼のピュールのNi-NTAスピンカラムに第二の細胞抽出物の3ミリリットルを適用します。 下部プラグと上部のスクリューキャップでカラムを密封し、樹脂を、無細胞抽出物で均等に分配されるまで軽くそれらを振ります。 4℃でオーバーヘッドシェーカーで30分間ロード列をインキュベートします。 2分間700×gで遠心分離することにより、洗浄用緩衝液1ml（20mMトリス、NaClを300mMのイミダゾールを20mM、pH7.4）でカラムを洗浄します。二回、この手順を繰り返します。 新鮮な円錐形の遠心チューブにカラムを配置し、溶出緩衝液の1ミリリットル（20mMトリス、NaClを300mMのイミダゾール250mMの、pH7.4）にOLET JEを追加します。 2分間700×gで遠心分離し、この手順を2回繰り返します。 注：イミダゾールは、ニッケルに結合し、したがって、列からOLET JEを削除します。 遠心分離フィルターユニットに溶出を転送する（10 kDaのMEMブレーン）と4℃で4000×gで遠心分離器は、イミダゾールを除去しました。 SDS緩衝液（最終濃度1×）で9ミックス溶出を3μl。SDS-PAGE（15％）により、酵素の純度を確認し、変性のために95℃で5分間のソリューションをインキュベートします。その後、SDS-PAGE上の合計金額を適用します。市販のタンパク質標準を使用して、35ミリアンペアでゲルを実行します。 50kDaのでタンパク質を検出します。 タンパク質濃度を決定するために市販のBSA-キットを使用します。ピペット希釈したタンパク質試料50μlの（1：100、1：200、1：500）およびBSA標準（0、20、30、40,50、60、80、100mgのミリリットル-1）を、96ウェルプレート中。 、Bradford試薬の200μlを添加し、蛍光光度計を用いて15分後に595nmで吸光度を測定し、標準曲線を用いて濃度を計算。 2.光触媒による生体内変化 過酸化水素を添加しない生体触媒反応蒸留水に10％（v / v）のTERGITOLおよび0.0284 gでステアリン酸を添加することによって、10mMのステアリン酸（M rを284.5グラムモル-1）10mlのストック溶液を調製します。脂肪酸が完全に溶解するまで60℃に加熱チャンバ内の溶液を加熱します。 生体触媒とサンプリング 50 mMのEDTA、0.01 mMのFMN、トリス塩酸緩衝液中で0.5 mMのステアリン酸を含有する2 2ミリリットルの反応混合物を準備します。十分な酸素供給のための磁気撹拌棒を加え、水浴中でガラス管を配置し、25℃に加熱しました。 反応混合物のそれぞれに精製された酵素を200μgml -1の10％（v / v）の無細胞抽出液を追加し、反応管を15cmの距離で透明ガラス電球（120 W）でそれらを照らします。 20μlの37％HClで反応停止させ、特定の時点（0、10、30、60および120分および一晩）に200μlのサンプルを取ります。 5μlのミリスチン酸を加える（10 mMストックので、内部標準としてリューション）。 反応生成物の分析 抽出のために、二回のサンプルに500μlの酢酸エチルを追加13,000×gで1分間のチューブと遠心分離機を反転。 上清の400μLを脱ぎ、溶媒を完全に蒸発させます。 200μLを加えることによって、trimethylsilylcarboxylic酸にカルボン酸を誘導体化N -メチル- N – （トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（MSTFA）。エーテルトリメチルシリルヒドロキシル基に変換するために、30分間、60℃で溶液をインキュベートします。 GC / FIDによる変換の決意 注：GC / FIDを使用して、α-およびβヒドロキシステアリン酸（RT：12.05および12.1分）と基板（11.15分RT）の減少：1ヘプタデセン（8.34分RT）の形成を決定します。 340℃に設定の下に注入温度を説明した温度プロファイルを設定します。ホールド初期オーブン温度は3.5分間、90℃であり、その後、分-1、45℃で増加します。 220℃では、2分間温度を保持します。 45℃分-1の繰り返し増加した後、2分間280℃の温度を保持し、次に分-1、60℃で増加します。 注：330°Cの最高温度は1.44分間保持されます。 キャリアガスヘリウムで急速に揮発し、均質な混合を得るために5の分割比で、サンプルの4μLを注入します。 注：温度の上昇に依存して基板および製品は、ガス相に入ります。物質は、特定の保持時間でカラムを通過した後、GC / FID検出器によって検出され、画面上のピークとして表示されます。モニター上のピークの形成を観察します。 次式によって形成される生成物の濃度を計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> 注：キャリブレーション係数は、誘導体化物質とそれに対応するピーク面積の既知量から標準曲線を計算することにより、各基板および製品については、このコラムのために特別に決定されています。 GC / MSによってオレフィンとβヒドロキシ酸のピークを特定します。 GC / MSによってオレフィンとβヒドロキシ酸のピークを特定します。温度プロファイルを設定します。 250℃に射出温度を設定します。 5分間100℃のオーブン温度を保持し、その後20℃の分-1で増加。 注：最大温度は7.5分間保持されます。 250°Cに質量分析計検出器温度を設定し、電子衝撃モードで50〜500のm / zで走査します。 注：電子衝撃イオン化質量分析のために前方に渡されるラジカルカチオンの形成をもたらす単一電子を除去します。原因内の高intramolarエネルギー共有結合へ下のm / zのフラグメントを作成する分子ブレーク。これらの断片は、物質の特定のフィンガープリントを形成します。 サンプルの1μLを注入します。対応するフィンガープリント（ 図2）により、11.4分の保持時間後に1ヘプタデセンを検出します。