Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Katharina K&#246;ninger; Marius Grote; Ioannis Zachos; Frank Hollmann; Robert Kourist

doi:10.3791/53439

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

Published: May 22, 2016

doi:

10.3791/53439

Katharina Köninger¹, Marius Grote¹, Ioannis Zachos¹, Frank Hollmann², Robert Kourist¹

¹Faculty of Biology and Biotechnology,Ruhr Universität Bochum, ²Biology and Biotechnology,Delft University of Technology

Summary

אנו מתארים פרוטוקול עבור דור האור היה זרז של מי חמצן – גורם-שותף עבור טרנספורמציות חמצונים.

Abstract

Oxidoreductases שייך האנזימים התעשייתיים ביותר להחיל. אף על פי כן, הם צריכים אלקטרונים חיצוניים אשר מספק בדרך כלל יקר ומאתגר. מחזור של NADH תורם אלקטרונים או NADPH מחייב השימוש של אנזימים נוספים מצעי הקרבה. מעניין, כמה oxidoreductases לקבל חמצן כתורם אלקטרונים. בעת היותו זול, מגיב זה לעתים קרובות מקטין את היציבות של אנזימים. פתרון לבעיה זו הוא הדור באתרו של הפקטור. האספקה הרציפה של הפקטור בריכוז נמוך שמניעה את התגובה מבלי לפגוע ביציבות אנזים. מסמך זה מדגים שיטה לייצור האור-catalyzed באתרו של מי חמצן עם הדוגמא של decarboxylase חומצת שומן תלוי heme OleT _י"א. Decarboxylase חומצות שומן OleT _JE התגלה בשל היכולת הייחודית שלנו להפיק 1-אלקנים ארוכי שרשרת מחומצות שומן, אנזימטי עד כה לא ידועתְגוּבָה. 1-אלקנים משמשים תוספים נרחבים plasticizers וחומרי סיכה. OleT _JE הוכח לקבל אלקטרונים מן מי חמצן עבור decarboxylation חמצוני. בעוד תוספת של נזקים מי חמצן האנזים וכתוצאה מכך תשואות נמוכות, בדור באתרו של פקטור עוקף את הבעיה הזאת. מערכת photobiocatalytic תערוכות יתרונות ברורים לגבי פעילות אנזים ואת התשואה, וכתוצאה מכך מערכת פשוטה ויעילה עבור decarboxylation חומצות שומן.

Introduction

השינוי באקלים ואת הדלדול הנראה לעין של משאבים מתחדשים מהווים איום רציני על החברה שלנו. בהקשר זה, קטליזה אנזים מייצג פוטנציאל עדיין לא מנוצל במלואו לפיתוח בר קיימא "ירוקה" כימית ^1. Oxidoreductases יש את היכולת לזרז את כניסתה ושינוי של קבוצות פונקציונליות בתנאי תגובות עדינים שייכים biocatalysts החשוב ביותר ^2. רוב טרנספורמציות החיזור דורשות האספקה החיצונית של קו-פקטורים כגון NAD (P) H. שיטות התחדשות פקטור יושמו בקנה מידה תעשייתי. עם זאת, הם עדיין לגרום עלויות גבוהות תהליך, אשר מגבילות את בקשתם בעיקר למוצרים בעלי ערך גבוה. מעניין, כמה peroxidases ^3,4 ו monooxygenases P450 ⁵ לקבל אלקטרונים מן מי חמצן דרך המחלף מי שנקרא. בעוד H ₂ O ₂ הוא שיתוף מגיב זול, זה הוא מדווח harmful עבור אנזימים רבים. יציב במבנה באתרו ריכוזים נמוכים של של מי חמצן הוא גישה מעשית לנהוג התגובה מבלי לפגוע היציבות התפעולית של אנזים.

איור 1. ניסיוני הגדרה של decarboxylation photobiocatalytic חומצות שומן על ידי OleT _JE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

השימוש באור כמקור אנרגיה עבור תהליכים כימיים וביולוגיים כבר מושך תשומת לב גוברת בשנים האחרונות ^6. אור מונחה הדור של מי חמצן התפתח שיטה קלה חזקה כדי לספק חמצן עבור טרנספורמציות חיזור (איור 1). Photocatalyst כגון פלבין אדנין mononucleotide (FMN) מאפשרת הסרה של חמצן מולקולרי למי חמצן, אשר לאחר מכן משמש פקטור עבור התגובה oxyfunctionalization האנזימטית. תורם אלקטרונים אפשריים הם חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ascorbate או formiate הזול. השיטה ישימה בדרך כלל H ₂ O ₂ אנזימים תלויים, כולל peroxidases ^3,4 ו P450 monooxygenases ^5.

חקרנו לאחרונה היישום של decarboxylase חיידקי הרומן ⁷ עבור הטרנספורמציה של שומנים טבעיים לתוך אולפינים ^8. זה יהיה מסלול קיימא לסינתזה של כימיקלי פלטפורמה בשימוש נרחב ממקור ביו מבוסס. Decarboxylase OleT _JE מן sp Jeotgalicoccus חיידק חיובי גרם. מזרז את חמצוני decarboxylation של חומצות שומן ויוצר 1-אלקנים כמוצרים. OleT _JE קשורה קשר הדוק monooxygenases P450 חיידקים ועליו אלקטרוני from מי חמצן עבור התגובה.

למרבה הצער, תוספת של H ₂ O ₂ פתרון של מצע אנזים שהסתיימה בהמרות נמוכות שחזור עניים של התוצאות, ככל הנראה עקב השפעה מזיקה של מי חמצן על יציבות OleT _י"א. דור של חלבון היתוך עם רדוקטאז NADPH RhFred עשה NADPH התלוי decarboxylation אפשרי. ⁹ עם זאת, המחיר הגבוה של NADPH והאפשרויות המוגבלות עבור התחדשות וחסכונית מתבקשים לנו לחקור תורמי אלקטרונים זולים. בהשראת הדמיון של OleT _JE עם monooxygenases P450, השתמשנו דור אור היה הזרז של H ₂ O _2. שמחנו לקבל המרות גבוהות (עד> 95%) באמצעות תמציות תא חינם או פתרונות אנזים מטוהרים.

עם הדוגמא של decarboxylation חומצות שומן, אנו מציגים פרוטוקול כללי enzym מונחים-אורטרנספורמציות חיזור atic באמצעות FMN כמו מי photocatalyst ומימן כמו-פקטור. השיטות שהוצגו כוללים את הייצור של האנזים בתא רקומביננטי של E. coli, טיהור של האנזים, היישום לסינתזה של 1-אלקנים ועל הניתוח של תוצרי התגובה.

Protocol

זהירות: יש להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כמה כימיקלים המשמשים סינתזות אלה בחריפות רעילים ומסרטנים. כל הצעדים מעורבים ממיסים אורגניים מזיקים, במיוחד החילוץ של תוצרי התגובה ואת derivatization של חומצות שומן חייב להתבצע תחת במנדף שימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות ). כל הפעולות הכרוכות אורגניזמים מהונדסים גנטית בעבודה זו דורשת התקנות שאושרו לטיפול של אורגניזמים מהונדסים גנטית של S1 בטיחות ברמה. 1. הביטוי של JE רקומביננטי decarboxylase OleT ב E. coli הכנה של זן הייצור הכן גן סינתטי של OleT JE מ Jeotgalicoccus ו משובטים לתוך וקטור ביטוי Pask-IBA37plus כמתואר. 8 </sup> הערה: כדי למנוע השפלה של חומצות שומן על ידי אנזימים מן מטבוליזם בקטריאלי, E. coli זן JW5020 מאוסף Keio עם מסלול מתפקד שפלת חומצות שומן היה בשימוש. טיפוח ואינדוקצית ביטוי אנזים כן-תרבות מראש על ידי לחסן את E. coli JW5020 OleT מוטציה מהצלחת LB-(המכיל 100 מיקרוגרם מ"ל -1 אמפיצילין) בשני 3 מ"ל LB-בינוני במבחנות. אמפיצילין פיפטה (100 מיקרוגרם מ"ל -1) מפתרון המניות לתוך המדיום לבחירה לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות בתוך חממה רועד ב 180 סל"ד. הוסף 2 מ"ל של תרבויות-מראש לשני 200 מ"ל LB-בינוני, אמפיצילין המכיל (100 מיקרוגרם מ"ל -1), צלוחיות שייק 1 L. הדגירה ממשיכה ב 37 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד. לפקח על שינוי 600nm OD לאחר החיסון. כאשר OD 600 מגיע לערך בין 0.6ד 0.8 להשרות את הביטוי על ידי הוספת טטרציקלין (0.2 מיקרוגרם מ"ל -1). דגירת התרבויות במשך 15 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד. הערה: מאז OleT JE מכיל פקטור heme, תוספת של δ-אמינו חומצה levulinic (0.5 מ"מ) לפני אינדוקציה שצריך כדי לספק תרבות עם מבשר לסינתזה פקטור. תמוגה Cell לבצע את הפעולות הבאות על קרח. מעביר את התרבויות באמצעות אחסון או pipetting לתוך צינורות צנטריפוגות ולהשתמש סולם כדי להבטיח חלוקה שווה. צנטריפוגה התרבויות במשך 20 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.. בזהירות להתעלמות supernatant ו resuspend את כדורי ב 50 מ"ל חיץ (טריס 50 מ"מ, 200 מ"מ NaCl, pH 7.5) על ידי pipetting ולהעביר את ההשעיה בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי. לאחר צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 4000 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant, resuspend כל גלולה ב 3 מ"ל חיץ ידי pipetting. בצע תמוגה התא על ידי כךnicating פתרונות על קרח (שלושה המחזורים x 30 שניות) עוזבים הפסקת דקות 1 בין המחזורים. צנטריפוגה הפתרונות במשך 20 דקות ב 15,000 XG ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי מבלי להפריע גלולה ידי pipetting. וזורק את הכדור. הערה: חלק ממס אחת ישמש ישירות Biocatalysis לאחר מולקולות קטנות יוסרו. השבר השני ישמש טיהור של JE OleT שלו מתויג. הסרת מולקולות קטנות של תמציות תא לפני השימוש בתמצית הגולמית Biocatalysis להסיר מולקולות קטנות אשר עלול להפריע לתהליך היווצרות מי חמצן או העברת אלקטרונים על ידי pipetting 3 מיליליטר של תמצית תא ללא ליחידת מסנן צנטריפוגות עם קרום צנטריפוגות 10 kDa ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend החלבון שנותרו 3 מ"ל טריס-HCl חיץ. טיהור OleT </strong> החל 3 מ"ל של תמצית התא השני לעמודות ספין Ni-נ.ת.ע פור שלו, אשר כבר equilibrated לפני עם חיץ איזון (טריס 20 מ"מ, NaCl 300 מ"מ, 10 מ"מ imidazole). חותם את העמודות עם האטם התחתון וכובעים-בורג עליונים ולנער אותם קל עד השרף מחולק באופן שווה עם תמצית התא ללא. דגירת העמודות נטענות במשך 30 דקות בתוך שייקר תקורה ב 4 ° C.. שטפו את העמודות עם 1 מ"ל של חיץ כביסה (טריס 20 מ"מ, NaCl 300 מ"מ, 20 מ"מ imidazole, pH 7.4) על ידי צנטריפוגה ב XG 700 במשך 2 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. מניחים את עמודות לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי טרי ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ elution (טריס 20 מ"מ, NaCl 300 מ"מ, 250 מ"מ imidazole, pH 7.4) OleT י"א. צנטריפוגה ב XG 700 במשך 2 דקות וחזור על שלב זה פעמיים. הערה: Imidazole יהיה לאגד ניקל ובכך להסיר OleT JE מהעמודה. מעבירים את elution ליחידה מסנן צנטריפוגות (10 ממ kDaטאי טען כי) ו צנטריפוגות ב 4000 XG ב 4 ° C כדי להסיר imidazole. בדוק את הטוהר של האנזים על ידי SDS-PAGE (15%). 9 מערבבים 3 μl של elution עם (1x הריכוז הסופי) SDS-חיץ דגירה הפתרון על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור denaturation. בהמשך להחיל את הסכום הכולל על SDS-PAGE. הפעל את הג'ל על 35 מילי-אמפר שימוש בתקן חלבון מסחרי. זיהוי החלבון ב 50 kDa. כדי לקבוע את ריכוז החלבון להשתמש-kit BSA מסחרי זמין. פיפטה 50 μl של דגימות חלבון מדולל (1: 100, 1: 200, 1: 500) ורמת BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 מ"ג מ"ל -1) בצלחת 96-היטב . הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד, למדוד את הספיגה ב 595 ננומטר לאחר 15 דקות עם fluorimeter ולחשב ריכוזים באמצעות עקומת הסטנדרט. 2. biotransformation אור-catalyzed תגובות biocatalytic ללא תוספת מי חמצן כן פתרון 10 מיליליטר מלאה של 10 מ"מ חומצה סטארית (M r 284.5 גרם mol -1) על ידי הוספת 10% (v / v) tergitol וחומצת 0.0284 גרם סטארית למים מזוקקים. מחמם את הפתרון בתא חימום עד 60 מעלות צלזיוס עד חומצת השומן נמסה לגמרי. Biocatalysis ודגימה הכינו שתי 2 מ"ל תערובות התגובה המכיל 50 mM EDTA, 0.01 מ"מ FMN, 0.5 חומצה סטארית מ"מ טריס-HCl חיץ. הוספת בר בחישה מגנטית לאספקת חמצן מספיק והמקום צינורות זכוכית באמבט מים, מחומם ל -25 מעלות צלזיוס. הוספת 200 מיקרוגרם מ"ל -1 של האנזים מטוהרים או 10% (v / v) תמצית התא ללא כל של תערובות התגובה ולהאיר אותם עם נורת זכוכית שקופה (120 W) במרחק 15 ס"מ של צינורות התגובה. קח 200 דגימות μl בנקודות זמן מסוימות (0, 10, 30, 60 ו -120 דקות ושוב ללילה) לעצור את התגובה עם 20 μl 37% HCl. הוסף 5 μl חומצה myristic (המניה 10 מ"מ כךlution) כסטנדרט פנימי. ניתוח של תוצרי התגובה להפקת להוסיף אתיל אצטט 500 μl על דגימות פעמיים, להפוך את הצינורות צנטריפוגות דקות 1 ב 13,000 x ז. תוריד 400 μl של supernatant ולתת ממס להתאדות לגמרי. Derivatize חומצות קרבוקסיליות לחומצה trimethylsilylcarboxylic על ידי הוספת 200 μl N -methyl- N – (trimethylsilyl) trifluoro acetamide (MSTFA). דגירת הפתרון על 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להמיר קבוצות הידרוקסיל כדי trimethylsilyl אתרים. קביעת ההמרה על ידי GC / FID הערה: בדוק את היווצרות של 1-heptadecene (RT: 8.34 דק '), חומצה סטארית α- ו β-הידרוקסי (RT: 12.05 ו 12.1 דקות) וירידה של המצע (RT: 11.15 דק') באמצעות GC / FID. הגדר את פרופיל הטמפרטורה מתואר להלן להגדיר את טמפרטורת ההזרקה 340 מעלות צלזיוס. לְהַחזִיקאת טמפרטורת התנור הראשונית היא ב -90 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות ולאחר מכן להגדיל עם 45 מעלות צלזיוס דקות -1. ב 220 מעלות צלזיוס, להחזיק את הטמפרטורה במשך 2 דקות. לאחר עלייה חוזרת של 45 ° C דקות -1, להחזיק את הטמפרטורה ב 280 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן להגדיל עם 60 מעלות צלזיוס דקות -1. הערה: טמפרטורה מרבית של 330 ° C הוא מוחזק 1.44 min. להזריק 4 μl של המדגם, עם יחס הפיצול של 5 כדי לקבל volatilization מהירה ערבוב הומוגני עם הליום גז המוביל. הערה: תלות טמפרטורת הגדלת המצע והמוצרים ייכנסו שלב הגז. החומרים מזוהים על ידי גלאי GC / FID לאחר שעבר את הטור פעמי שמירה ספציפיות מוצגים כמו פסגות על המסך. לצפות את היווצרות שיא בצג. חשב את הריכוז של המוצר שנוצר על פי הנוסחה הבאה: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/> הערה: הגורם הכיול נקבע במיוחד עבור עמודה זו עבור כל מצע מוצר על ידי חישוב עקום הסטנדרט מן לסכומים ידועים של חומרי derivatized ואזור השיא המקביל שלהם. לזהות פסגות חומצה אולפינים ו β-הידרוקסי ידי GC / MS. לזהות פסגות חומצה אולפינים ו β-הידרוקסי ידי GC / MS. הגדר את פרופיל הטמפרטורה. הגדר את הטמפרטורה הזרקת 250 מעלות צלזיוס. החזק את הטמפרטורה בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להגדיל עם 20 מעלות צלזיוס דקות -1. הערה: טמפרטורה מרבית מוחזק עבור 7.5 דקות. הגדר את הטמפרטורה גלאי ספקטרומטר מסה עד 250 ° C ו לסרוק 50 עד 500 מ '/ z במצב השפעה אלקטרונים. הערה: יינון השפעה אלקטרונים מסירה אלקטרון בודד וכתוצאה מכך היווצרות של קטיון רדיקלי אשר יועברו קדימה לניתוח המוני. בשל קשרי קוולנטיים אנרגית intramolar גבוהים בתוךהפסקת מולקולת יצירה שברי m / z הנמוך. שברים אלה יוצרים טביעת אצבע ספציפית חומר. להזריק 1 μl של המדגם. זיהוי 1-Heptadecene לאחר זמן שמירה 11.4 דקות על ידי טביעת האצבע המקבילה (איור 2).

Representative Results

בעוד התוספת של מי חמצן לתערובת התגובה הביאה נמוך עד בינוני מרות (<10%), בדור באתרו של מי חמצן מוגבר ההמרה עד מרת 80%. ניתוח על פי GC / MS מציג את ההיווצרות של אולפינים מחומצות שומן (איור 2). איור 2. (א) פרופיל טמפרטורה למדידות GC / MS. (ב) טביעות אצבע של משחררי 1-heptadecene אחרי 11.4 דקות. (C) יונים שבר מאפיין משני C n H 2n-1 של למופת אולפינים מסוף המוצגים עבור 1-heptadecene. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> תגובת האור-catalyzed השיגה המרות גבוהות עם תמציות ללא תאים של E. coli. פתרון אנזים מטוהר הראה מתאם ברור בין ריכוז אנזים ומר. הגדלת הריכוז של עופרת FMN מולקולת אור-קציר להמרות גבוהה. עם זאת, להגדיל את הריכוז מעל 10 מ"מ לא נוספת להאיץ את התגובות, המציין את כמות מי חמצן זמין מספיק כבר לא הגורם המגביל. בנוסף decarboxylation של חומצות שומן, OleT JE גם מזרז hydroxylation in-העמדה β. המרה של חומצה סטארית, את decarboxylation הוא מהיר בערך פי שלושה מאשר hydroxylation. בניסוי טיפוסי באמצעות פתרון של חומצה סטארית 0.5 מ"מ ו 10 מיקרומטר FMN, 99% של המצע הוסבו תערובת של 1-heptadecene וחומצה 2-hydroxystearic עם יחס של3.3: 1 (איור 3) 8. מבדיקה של הספקטרום המצע של Biocatalysis מונחי-האור הראו כי חומצות שומן עם שרשראות acyl עוד, OleT JE מועדף מזרז את decarboxylation, בעוד הכמות היחסית של חומצות שומן הידרוקסיל בתערובת המוצר גדל עם אורך שרשרת קצר. חומצות שומן קצרות יותר חומצת myristic (C14) שלא עברו decarboxylation. איור 3. ניתוח chromatographic גז של OleT JE בתיווך decarboxylation של חומצה סטארית (11.15 דק ') לתוך 1-heptadecene (8.4 דק'), חומצה סטארית-הידרוקסי α (12.04 דק ') חומצה סטארית β-הידרוקסי (12.1 דק'). השינוי של אזורי השיא ממדגמים השתלטו קורס פעמי של 2 hr מוצג. נא ללחוץ כאן vieווה גרסה גדולה יותר של דמות זו. באופן מפתיע, חומצה אולאית בלתי רוויות חומצות (C18: 1d9 cis) וחומצה לינולאית (C18: 2d9d12) לא נתקבלו כמו מצעים, המציין כי תצורת המעוות של קשרים כפולים ציס לא ניתן לאכלס מצב מחייב פרודוקטיבי האנזים. תוספת של חומצה אולאית (10%) גם מנעה את ההמרה של חומצה סטארית. מעניין, חומצה סטארית (C18: 1d9 טרנס) הוסב על ידי OleT JE, עדיין עם פעילות נמוכה מעט ואז חומצה סטארית.

Discussion

דור מונחים-האור של מי חמצן יכול להיות מיושם עבור טרנספורמציות חיזור טווח, כולל peroxygenases ^3, chloroperoxidases ¹⁰ ו P450 monooxygenases ^5. זוהי גישה קלה מבחינה מעשית. בטווח הארוך, את השימוש של אור הנראה פותח המבט לנצל את אור שמש טרנספורמציות כימיות, המהווה חלופה בת קיימא לתגובות אנרגיה עשירה.

השיטה ישימה עם אנזים מטוהר או עם תמצית תא ללא. בעוד שהאחרון דורש פחות עלות ועבודה, יש לציין כי מולקולות קטנות בקטע הגולמי עלולות להפריע המרה היה זרז האור. גישה מעשית היא להסיר רכיבים קטנים אלה עם micromembrane (כלומר, על ידי צנטריפוגה ביחידה מסננת צנטריפוגלי או על ידי דיאליזה). ריכוז של המולקולה אור-קציר FMN קובע את הריכוז של מי חמצן. בהתאם affinity של oxidoreductase, ריכוז זה יש משקל מכריע הפעילות האנזימטית. גורם חשוב נוסף הוא הריכוז של EDTA תורם אלקטרון ההקרבה. הפרמטר החשוב ביותר, לעומת זאת, הוא היציבות התפעולית הפעילות של האנזים.

Olefinization של חומצות שומן הוא תגובה אלגנטית עבור ההמרה של חומצות שומן ביו המבוסס לתוך אולפינים ששייכים הסחורות הגדולות לתעשייה הכימית. Decarboxylation biocatalytic מונחה האור יכול להתבצע בטמפרטורת החדר ב- pH נייטרלי, אשר מציעה יתרונות ברורים במונחים של אחריות סביבתית.

התוצאות שלנו מראות כי בדור באתרו של מי חמצן היא אסטרטגיה לספק את הפקטור מבלי לפגוע ביציבות אנזים, אשר מוביל להמרה גבוהה. שיטות הווה להתחדשות פקטור להשתמש במוצרים חקלאיים או כימיקלים מבוססי נפט. אור מונע תגובות הם מתעוררים כמו אלטרנטיבה מתחדשת. עתידמחקר יוקדש שיטות ההחלפה של EDTA מגיב ההקרבה ידי מולקולות זולות כדי להפחית את הכמות של FMN המולקולה-קציר אור.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Materials

Chemicals
Ampicillin	Sigma Aldrich	69-52-3
Bradford reagent	Roth	K015.1
BSA	Sigma Aldrich	90604-29-8
DMSO	Sigma Aldrich	67-68-5
Ethyl acetate	Fisher Chemical	141-78-6
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Roth	8043.1
Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate	Sigma Aldrich	130-40-5
Hydrochlorid acid 37%	Sigma Aldrich	7647-01-0
Hydrogen peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1
δ-Amino levulinic acid	Sigma Aldrich	5451-09-2
N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)	Sigma Aldrich	24589-78-4
Myristic acid >99%	Sigma Aldrich	208-875-2
Imidazole	Sigma Aldrich	288-32-4
Sodium chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Stearic acid >99%	Sigma Aldrich	57-11-4
Tetracycline	Sigma Aldrich	60-54-8
Tergitol	Sigma Aldrich	MFCD01779855
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Sigma Aldrich	77-86-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Device
Incubator shaker	G-25CK	New Brunswick Scientific
	Ecotron	Infors HT
Centrifugation	Labofuge 400R	Heraeus
	RC 5B Plus	Sorvall
	Fresco 17	Thermo Scientific
Centrifugation rotors	SS34	Sorvall
	SLA	Sorvall
Clean bench	Envirco	Ceag Schirp Reinraum technik
Column GC-FID	CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 µm)	Agilent Technologies
Column GC-MS	FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)	Varian
GC-FID	GC-2010 plus	Shimadzu
GC-MS	IST-40	Varian
Magnetic stirrer	RCT classic	IKA
pH meter	SevenEasy	Mettler toledo
Sonicator	Branson Sonifier 250	Branson
Spectral photometer	FLUOstar Omega	BMG Labtech
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Affinity chromatography column	His Pur Ni-NTA spin column	Thermo Scientific
Centricon	Vivaspin turbo 15	VWR International
Microtiter plates	96 Well Multiply®PCR Plates	Sarstedt

References

Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens – recent trends and developments. Green Chem. , 2607-2618 (2011).
Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations. Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).
Churakova, E., et al. Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions. Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).
Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods. ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).
Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases. Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).
Bartsch, M., et al. Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts. Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).
Rude, M. A., et al. Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).
Zachos, I., et al. Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis. Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).
Liu, Y., et al. Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase. Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).
Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions. Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Köninger, K., Grote, M., Zachos, I., Hollmann, F., Kourist, R. Light-driven Enzymatic Decarboxylation. J. Vis. Exp. (111), e53439, doi:10.3791/53439 (2016).

Automatically Generated