Tissue Triage en Invriezen Modellen van Skeletal Muscle Disease

Skeletspier is een structureel en functioneel uniek weefsel, en gespecialiseerde voorbereiding procedures zijn noodzakelijk om de optimale beoordeling van de structurele en functionele parameters mogelijk te maken. Terwijl een groot aantal weefsels vaak voor pathologische studies in de klinische en onderzoek contexten zijn bevroren, bevriezen protocollen voor niet-spierweefsel meestal om de totale onderdompeling van het weefsel in oktober voor het invriezen. Zoals getoond in figuur 3, een dergelijk protocol is geschikt voor pathologische evaluatie van de skeletspieren en toch voldoende overeenstemming van de hier beschreven protocol dat dit een veel voorkomende fout. Het doel van dit artikel is een eenvoudig protocol voor de correcte afhandeling van de spier te bieden aan dit soort zaken te voorkomen. Advies is ook opgesteld op de correcte afhandeling van de spier voor off-site fysiologische en cellulaire studies in een poging om de overname van de hoge kwaliteit van de gegevens door externe kern laboratoria in gevallen vergemakkelijken wheopnieuw ter studies niet de voorkeur of mogelijk.

Zoals in dit protocol, elementen die absoluut essentieel voor de juiste bewerking van spieren voor pathologische studies omvatten het minimaliseren van het watergehalte van het weefsel, het verminderen van de temperatuur waarbij de spier wordt bevroren, en het verhogen van de snelheid waarmee het vriespunt wordt bereikt. Overmatig vocht in het weefsel of overmatig traagheid van het invriezen (geproduceerd door onvoldoende temperaturen of door een gebrek aan direct contact tussen de bevriezing middel en het weefsel, zoals ondervonden met vloeibare stikstof) zal leiden tot het bevriezen van artefacten die pathologische analyse kan aantasten. Als oktober levert een extra bron van weefselvocht, vele laboratoria plakmiddelen zoals tragacanth als inbedding substraat. Zelfs in gevallen waarin het vriespunt op de juiste wijze wordt uitgevoerd, moet ervoor worden gezorgd dat vervolgens per ongeluk ontdooien exemplaren voorkomen door contact met RT containers of instrumenten.Dus een succesvolle vriesproces vereist een zekere planning die vooraf koelen van alle instrumenten en de te gebruiken omvat. Bij het invriezen artefacten worden aangetroffen, is een werkwijze beschreven voor het herstel van het weefsel dat is voldoende voor de meeste pathologische evaluaties. Echter, deze vries / dooi cyclus niet perfect histologie bieden en heeft het potentieel om andere moleculaire of enzymatische studies van het weefsel (naast de tijd voor het opnieuw invriezen van het weefsel) beïnvloeden, zodat met geschikte eerste bevriezing praktijken verreweg de voorkeur . Wanneer invriezen artefact wordt aangetroffen op vooraf bevroren weefsel, maar de hierin beschreven techniek kan zeer nuttig zijn.

Fixatie en verwerking van weefsel voor EM kan specifieke technische uitdagingen die planning voorafgaand aan weefsel collectie vereisen. De meest voorkomende fout bij het verzamelen van monsters voor EM omvat het gebruik van weefsel fragmenten die te dik zijn glutaraldehyde doordringen. Glutaaraldehyd dringt slechts ongeveer 0,1 cm in het spierweefsel van een bepaald oppervlak moet ervoor worden gezorgd dat een dimensie van de EM monsters niet dikker dan 0,2 cm. Daarnaast, zoals EM is een uitstekend middel rechtstreeks gewaardeerd het contractiele apparaat, sommige onderzoekers hebben strategieën ontwikkeld om voorspanning of voorrek de spier voor bevestiging aan de meting van contractiele elementen dat bij een fysiologisch relevante spanning. Er is geen standaard protocol voor voorspanning, maar twee strategieën worden kort beschreven in dit protocol. Opgemerkt zij dat probeert voorspanning de spier kan onvoorspelbare resultaten tenzij zij gedaan in een zeer specifieke manier, en het kan de voorkeur verdienen om spieren vast in slappe toestand te artefactuele veranderingen in sarcomeer lengte te voorkomen door een afwijkende pre-spanprocedure ^8,9. Voor spieren waarin dergelijke metingen zijn niet nodig (waaronder de meeste biopsies uitgevoerd voor klinische doeleinden), inspanningen voorspanning de spier algemeen niet gemaakt, en het hoofdeffect op spiermorfologie een niet-uniforme verdeling van sarcomeren in de spier.

Dit document is de eerste in een reeks SOP's voor het uitvoeren van tests op het gebied aangeboren spierziekte, en het vertegenwoordigt de inspanningen van meer dan 20 experts op het aangeboren spierziekte veld dat routinematig uitvoeren van cellulaire, moleculaire, functionele, fysiologische en pathologisch onderzoek. Een reeks van gepubliceerde SOP's zullen beschikbaar worden gesteld in het komende jaar, en de nodige protocollen en passende bekendmaking formaten voor elke besproken in een aangeboren spierziekte Consortium Workshop gehouden in april 2013 in Washington DC Het doel van deze SOP inspanning is te voorzien een routekaart voor de nodige testen en analyseren van monsters in de spier veld aangeboren ziekte tot 1) standaardisering van de praktijken en eindpunten gebruikt in ons vakgebied als much mogelijk, en 2) geven instructie op standaard praktijken voor nieuwe onderzoekers in ons vakgebied. Wij zijn van mening dat deze middelen de komst van nieuwe onderzoekers in onze onder-bestudeerde veld zal vergemakkelijken en aldus de reikwijdte van het onderzoek die kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast zal er een standaardisatie van praktijken zeer nuttig zijn om gegevens over studies te vergelijken en eindpunten vast te stellen bij het plannen en uitvoeren van preklinische en klinische proeven.

Terwijl de belangrijkste focus van dit artikel heeft betrekking op de juiste invriezen en bereiding van weefsel voor verschillende studies, onze gezamenlijke groep besproken de nuttige eindpunten voor de pathologische analyse van monsters spier. Momenteel is er geen officiële consensus over de aanpak houden bij het uitvoeren pathologische analyse en een verscheidenheid van verschillende studies uitgevoerd om nieuwe bevindingen betrekking op voorgaande publicaties voor iedere respectieve ziekte. Dus we dachten dat het nuttig zou zijnstellen enkele algemene richtlijnen voor de planning van pathologische eindpunten in de spieren pathologie karakterisering. Voorafgaand aan het kwantificeren van de pathologie in een studie, moet nagedacht in gebracht: 1) de methode van fiber maat opmeten, 2) de mogelijkheid van een vezel-type-specifieke afwijkingen of effecten van de behandeling, 3) de mogelijkheid van afwijkingen of effecten die beperkt individuele spieren, en 4) een strategie voor het kwantificeren pathologische bevindingen die karakteristiek voor de ziekte onder studie. Vezelgrootte is een noodzakelijke eindpunt voor de meeste studies, en helaas is er een uitgebreide variatie in de manier waarop het wordt gekwantificeerd. Veel studies rapporteren deze resultaten met behulp van geautomatiseerde kwantificering die door proprietary imaging software, maar veel van deze programma's nemen sneltoetsen (zoals in de veronderstelling dat de vezels zijn cirkels of ellipsen) dat deze geautomatiseerde metingen onnauwkeurig kunnen maken. Het is noodzakelijk om te begrijpen hoe deze geautomatiseerde programma's maken hun metingen boordat hebben vertrouwen in de metingen, en we moedigen onderzoekers om deze gegevens op te nemen in papier-methoden. Daarnaast is de specifieke meting gebruikt om vezelgrootte duiden is uiterst variabel en sommige metingen zijn te verkiezen boven anderen ^10,11. Een veelgebruikte eenheid vezelgrootte is de vezel doorsnede (CSA), vooral omdat onderzoekers uitvoeren fysiologische studies standaardiseren van resultaten CSA metingen verkregen met de instrumenten. Helaas, terwijl CSA metingen nauwkeurig reflecteren vezelgrootte in perfecte dwarsdoorsneden, zij uitvoerig afhankelijk vezeloriëntatie (voorzover lengte of schuin doorgesneden vezels kunstmatig hoge CSA metingen hebben) en zijn dus niet ideaal voor metingen vezelgrootte. Een voorkeur meting vezels grootte die minder afhankelijk vezel dwarsdoorsnede is de diameter van de minimum Feret (MinFeret diameter), die de meting van ee minor diameter in de spiercel ^12. Deze meting is slechts weinig afhankelijk vezeloriëntatie is gewoonlijk de klinische gouden standaard voor vezels meting en onderzoekers ertoe bewegen naar het gebruik van deze techniek. Deze metingen kunnen vaak worden uitgevoerd met behulp van dezelfde software die CSA metingen genereert ¹³ en ook eenvoudig handmatig meten. Met betrekking tot de evaluatie van de pathologische gegevens naar soort vezel, specifiek spier, en in de context van pathologische bevindingen met betrekking tot de specifieke ziekte, deze zijn minder controversiële kwesties die alleen tijdens de planning van een onderzoek moet worden overwogen. Vezeltype kan worden geëvalueerd middels immunohistochemische kleuring of ATPase, maar het is nuttig om te overwegen die specifieke spieren en diersoorten specifieke mengsels van deze typen vezels (dus noodzakelijk verschillende verwachtingen en teststrategieën). Muscle specifieke pathologische betrokkenheid of werkzaamheid van de behandelingoptreden, en totaalgewicht spier vergeleken met controles kunnen worden gebruikt om de mate van heterogeniteit van de ziekte te identificeren alvorens over het spieren pathologisch evalueren. Tenslotte is het bekend dat veel spierziekten worden geassocieerd met specifieke pathologische afwijkingen (bijvoorbeeld nemaline staven nemaline myopathie) ^14,15, en dus is ook nuttig om te overwegen of deze afwijkingen worden gevonden in een vezel-type of spier -specifieke verdeling bij het ​​uitvoeren van de analyse ^16,17. Over het algemeen, terwijl wij geen voorstellen doen voor een starre set van normen voor de evaluatie van de spier, geloven we dat deze kwesties voorafgaand aan de uitvoering van pathologische studies in elke skeletspier ziekte moet worden beschouwd.