Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

O músculo esquelético é um tecido estrutural e funcionalmente única, e os procedimentos de preparação especializadas são necessárias para permitir a avaliação ótima de parâmetros estruturais e funcionais. Enquanto uma variedade de tecidos são normalmente congeladas para estudos patológicos em contextos clínicos e de pesquisa, os protocolos de congelação para não-tecidos musculares usualmente envolvem a imersão total do tecido em OCT, antes da congelação. Como mostrado na Figura 3, um tal protocolo é inadequado para a avaliação patológica do músculo esquelético e no entanto é bastante parecido com o protocolo descrito aqui que este é um erro normalmente encontrado. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo simples para o tratamento adequado da musculatura para evitar problemas como este. Conselho também foi compilado no tratamento adequado dos músculos para fora do local fisiológico e estudos celulares, em um esforço para facilitar a aquisição de dados de alta qualidade pelos laboratórios centrais de fora em casos where estudos no local não são preferíveis ou possível.

Conforme observado neste protocolo, elementos que são absolutamente essencial no processamento adequado do músculo para estudos patológicos incluem minimizar o conteúdo de água do tecido, diminuindo a temperatura a que o músculo está congelado, e aumentando a velocidade a que é atingido o congelamento. A umidade excessiva dentro do tecido ou lentidão excessiva do processo de congelamento (produzido por temperaturas insuficientes ou pela falta de contato direto entre o agente de congelamento e do tecido, como é encontrado com nitrogênio líquido) vai levar a congelamento artefatos que podem prejudicar a análise patológica. Como outubro fornece uma fonte adicional de humidade nos tecidos, muitos laboratórios usam outros adesivos como goma tragacanth como substrato incorporação. Mesmo nos casos em que o congelamento é realizado de forma adequada, cuidados devem ser tomados para evitar posteriormente descongelar acidentalmente espécimes através do contato com recipientes ou instrumentos RT.Assim, um processo de congelação bem sucedida requer um grau de planeamento, que inclui um pré-refrigeração de todos os instrumentos e os recipientes a ser usados. Quando artefactos de congelamento são encontrados, existe um método aqui descrito, para a recuperação do tecido que é suficiente para a maioria das avaliações patológicas. No entanto, este ciclo de congelamento / descongelamento não oferece histologia perfeito e tem o potencial de prejudicar a outros estudos moleculares ou enzimáticas do tecido (para além do tempo necessário para voltar a congelar o tecido), de modo usando práticas apropriadas de congelamento inicial é muito preferível . Nos casos em que o congelamento artefacto é encontrado no tecido pré-congelado, no entanto, a técnica aqui descrita pode ser extremamente útil.

Fixação e processamento de tecido para EM podem oferecer desafios técnicos específicos que exigem planejamento antes da coleta do tecido. O erro mais comum ao coletar espécimes para EM envolve o uso de fragmentos de tecidos que são muito espessas para glutaraldehyde para penetrar. Como glutaraldeído só penetra aproximadamente 0,1 cm no tecido muscular de uma superfície dada, cuidados devem ser tomados para garantir que uma das dimensões das amostras de EM não é mais espessa do que 0,2 cm. Além disso, como o EM é um excelente meio de avaliar diretamente o aparelho contrátil, alguns pesquisadores têm desenvolvido estratégias de pré-tensão ou pré-estiramento no músculo antes da fixação para permitir a medição de elementos contráteis a uma tensão fisiologicamente relevante. Não existe um protocolo padrão para o pré-tensionamento, mas duas estratégias são descritas resumidamente neste protocolo. Deve notar-se que as tentativas de pré-tensionamento do músculo pode produzir resultados imprevisíveis a menos que sejam feitas de uma forma muito específica, e que pode ser preferível fixar os músculos no estado de folga para evitar alterações de comprimento artefatuais sarcómero por meio de um não-padrão procedimento de pré-tensionamento ^8,9. Para os músculos em que tais medidas específicas não são necessárias (incluindo mais biopsies realizadas para fins clínicos), os esforços de pré-tensão do músculo em geral, não são feitas, e o principal efeito sobre a morfologia do músculo é um espaçamento não uniforme das sarcomeres no músculo.

Este trabalho representa o primeiro de uma série para fornecer SOPs para a realização de ensaios de campo doença muscular congênita, e representa os esforços de mais de 20 especialistas na área doença congênita do músculo que rotineiramente celular, molecular e funcional, fisiológico e investigação patológica. Uma gama de SOPs publicados serão disponibilizados ao longo do ano que vem, e os protocolos necessários e formatos de publicação apropriadas para cada foram discutidos em uma Muscle Congênita Doenças Consórcio Oficina realizada em abril de 2013, em Washington DC O objetivo deste esforço SOP é fornecer um roteiro para os testes necessários e análise de amostras no campo congênita doença muscular a 1) padronizar as práticas e os terminais utilizados em nosso campo como muito possível, e 2) fornecer instruções sobre as práticas padrão para novos pesquisadores em nosso campo. Acreditamos que esses recursos vão facilitar a entrada de novos pesquisadores em nosso campo de sub-estudado e, assim, melhorar o âmbito da investigação que podem ser executadas. Além disso, a padronização das práticas será extremamente útil para comparar os dados entre os estudos e identificar os pontos de extremidade quando o planejamento e realização de ensaios pré-clínicos e clínicos.

Embora o foco principal deste artigo está relacionado ao congelamento e preparo de tecido apropriado para uma variedade de estudos, o nosso grupo colaborativo também discutiu os parâmetros úteis para a análise patológica de amostras musculares. No momento, não há consenso oficial sobre a abordagem a tomar quando se realiza a análise patológica, e uma variedade de diferentes estudos são realizados para relacionar as novas descobertas de publicações anteriores para cada uma das doenças visadas. Assim, pensamos que seria útil parapropor algumas diretrizes gerais para o planejamento de endpoints patológicas no músculo patologia caracterização. Antes de quantificar a patologia em um estudo, o pensamento considerável deve ser colocado em 1) o método de medição do tamanho da fibra, 2) a possibilidade de anomalias de fibra de tipo específico, ou os efeitos do tratamento, 3) a possibilidade de anormalidades ou efeitos que são restritos de músculos individuais, e 4) uma estratégia para quantificar alterações patológicas que são característicos para a doença sob estudo. Tamanho da fibra é um ponto final necessário para a maioria dos estudos, e, infelizmente, há extensa variação na forma como é quantificado. Muitos estudos relatam esses resultados usando métodos de quantificação automatizados fornecidos pelo software de imagem proprietário, mas muitos desses programas tomar atalhos (como assumindo que as fibras são círculos ou elipses) que podem tornar essas medições automatizadas impreciso. É necessário entender como esses programas automatizados fazer suas medições bntes de ter confiança nas medidas, e nós encorajamos os investigadores para incluir esses detalhes nos métodos de papel. Além disso, a medida específica usada para indicar o tamanho da fibra é extremamente variável, e algumas medições são preferíveis a outros ^10,11. Uma medida comumente utilizada de tamanho da fibra é a área da seção transversal da fibra (CSA), principalmente porque os investigadores realizam estudos fisiológicos padronizar os resultados das medições CSA obtidos utilizando os seus instrumentos. Infelizmente, enquanto que as medições de CSA pode reflectir com precisão o tamanho da fibra, em secções transversais perfeitos, eles são largamente dependente da orientação da fibra (na medida em que as fibras longitudinais ou obliquamente seccionados terá medições CSA artificialmente altos) e são, assim, as medições não ideais para o tamanho da fibra. A medição do tamanho preferível de fibra que é menos dependente de fibra de área de secção transversal é o diâmetro de Feret mínimo (diâmetro MinFeret), que é a medida de the diâmetro menor na célula muscular ^12. Esta medida é apenas um pouco dependente de orientação das fibras e geralmente é o padrão-ouro para a medida clínica da fibra, e os investigadores são encorajados a se mover para o uso desta técnica. Estas medições podem frequentemente ser feitos usando o mesmo software que gera medições CSA ^13, e também são fáceis de medir manualmente. Com relação à avaliação dos dados patológicos de acordo com o tipo de fibra, músculo específico, e no contexto de achados patológicos relacionados com a doença específica, estas são questões menos controversas que devem apenas ser considerados durante o planejamento de um estudo. O tipo de fibra pode ser avaliada usando coloração imuno-histoquímica ou ATPase, mas é útil considerar que os músculos específicos e espécies animais têm misturas específicas desses tipos de fibras (necessitando, assim, expectativas diferentes e testar estratégias). Envolvimento patológico específico muscular ou a eficácia do tratamentopodem ocorrer, e peso do músculo do total em comparação com os controlos podem ser utilizados para identificar o grau de heterogeneidade da doença antes de decidir sobre os músculos para avaliar patologicamente. Finalmente, é bem sabido que muitas doenças musculares estão associadas a anomalias patológicas específicas (tais como barras de nemaline em miopatia nemalínica ^14,15), e por isso também é útil para determinar se estas anormalidades são encontradas num tipo de fibra muscular ou -específica de distribuição ao realizar a análise ^16,17. Em geral, embora nós não propor um conjunto inflexível de normas para a avaliação do músculo, nós acreditamos que estas questões devem ser consideradas antes da realização de estudos patológicos de qualquer doença do músculo esquelético.