Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
İskelet kası, çünkü işlevsel hücresel, moleküler ve patolojik değerlendirme en iyi sonuçları elde etmek için doku toplama için özel protokoller gerektirir yapısı ve işlevi, eşsiz bir dokudur. Doğuştan kas hastalığı iskelet kas değerlendirirken nedeniyle doğuştan kas hastalıkları ve bu özelliklerin tanınması ile müdahale tespit için potansiyel görülen bazı patolojik anormalliklerin incelik için, dondurulmuş kas patolojik değerlendirilmesi sabit kas tercih edilir. Diğer dokular dondurulurken, yaygın olarak kullanılmaz, histolojik inceleme için iskelet kas dondurma ek olarak, kas ağır dondurma eserler üretilmesi için muhtemel özel önlemleri gerektirir. Bu makale uygun iskelet kası morfolojisi korumak için sıvı nitrojen ile soğutulur izopentan (2-metilbütan) kullanılarak iskelet kası hızlı dondurulması için bir protokol açıklamaktadır. Bu işlem aynı zamanda f etkilidirgenetik ve protein ifade çalışmaları için tasarlanmıştır doku reezing. Ayrıca, biz toplamak için gerekli minimum çaba odaklanarak da (1) Tek lif fonksiyonel çalışmalar ve (2) myoblast hücre kültürü için doku kısa vadeli triajın için tercih edilen yöntemleri açıklayan geniş bir prosedür, içine bizim dondurma protokolü entegre etmiş doku ve bu çalışmaları tamamlamak için özel bir araştırma veya referans laboratuarları nakleder. Genel olarak, bu el yazması taze doku etkili fenotipik çalışmalar çeşitli dağıtılmış olabilir nasıl bir taslağını sağlayan ve böylece doğuştan kas hastalığı ile ilgili patolojik çalışmalar için standart işletim prosedürleri (SOP) sağlar.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
İskelet kası bir yapısal ve işlevsel benzersiz dokusu ve özel hazırlık prosedürleri yapısal ve fonksiyonel parametrelerin optimum değerlendirmesini sağlamak için gereklidir. Dokuların çeşitli yaygın klinik ve araştırma bağlamlarda patolojik çalışmalar için dondurulur birlikte, non-kas dokuları için donma protokoller genellikle dondurma işleminden önce Ekim dokusunun toplam daldırma içerir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, bu tür bir protokol iskelet kası patolojik değerlendirilmesi için uygun olan ve yine de bu sık karşılaşılan hata olduğu burada tarif edilen protokol için yeterince benzer. Bu yazının amacı bu gibi sorunları önlemek için kas doğru kullanımı için basit bir protokol sağlamaktır. Önerileri de durumlarda çekirdeği dışında laboratuvarlar tarafından yüksek kaliteli veri kazanımını kolaylaştırmak amacıyla off-site fizyolojik ve hücresel çalışmalar için kas doğru kullanımı üzerinde derlenmiştir where yerinde çalışmalar tercih veya mümkün değildir.
Bu protokolde belirtildiği gibi, patolojik çalışmalar için kas uygun işlem kesinlikle gerekli olan elemanları, doku su içeriği minimize kas dondurulur sıcaklığın azaltılması ve dondurma elde edilir hızını artırarak içerir. Doku veya (sıvı azot ile karşılaşıldığında yetersiz sıcaklıkları ile ya da dondurma maddesi ve doku arasında doğrudan bir temas olmaması, tarafından üretilmiş) dondurma işleminin aşırı yavaşlık olan aşırı nem patolojik analizi bozabilir eserler dondurma yol açacaktır. Ekim doku nem ek bir kaynak sağlar gibi, birçok laboratuvarda bir gömme alt tabaka olarak kitre zamkı gibi diğer yapıştırıcılar kullanın. Hatta donma uygun gerçekleştirilir durumlarda, bakım RT konteynerler veya aletlerle temas yoluyla sonradan yanlışlıkla çözülme örnekleri önlemek için alınmalıdır.Bu nedenle, bir dondurma işleminin başarılı kullanılacak tüm aletler ve konteynerlerin bir ön soğutma içeren planlama derecesi gerektirir. Dondurma eserler karşılaşılan zaman, çoğu patolojik değerlendirme için yeterli olan doku kurtarma için burada tarif edilen bir yöntem yoktur. Bununla birlikte, bu dondurma / çözme döngüsü mükemmel histoloji sunmak ve (yeniden dondurma doku için gerekli olan zaman ek olarak) doku diğer moleküler ya da enzimatik çalışmaları zarar potansiyeline sahip, çok uygun başlangıç donma uygulamaları kullanarak çok tercih edilir etmez . Donma artefakt, önceden dondurulmuş dokuda karşılaşılan durumlarda, ancak burada tarif edilen teknik, son derece yararlı olabilir.
EM önce doku toplama planlama gerektiren özel teknik zorlukları sunabilir için doku tespiti ve işlenmesi. EM için numune toplama En sık karşılaşılan hata glutaraldehyd için çok kalındır doku parçalarının kullanımını gerektirire nüfuz. Glutaraldehit, sadece belirli bir yüzey, bakım kas dokusu içine, yaklaşık 0.1 cm nüfuz olarak EM örneklerinin bir boyuta kalın 0.2 'den cm olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. EM doğrudan kasılma cihazı değerlendirerek mükemmel bir araçtır Buna ek olarak, bazı araştırmacılar stratejiler geliştirdik kas öncesinde tespit öncesi gerginlik veya önceden streç fizyolojik ilgili bir gerilimde kontraktil elemanların ölçümü izin için. Orada ön-germe için standart bir protokoldür, ancak iki strateji kısaca bu protokolü tarif edilmiştir. Onlar çok özel bir şekilde yapılır ve bir standart dışı ile sarkomer uzunluğu artifaktüel değişiklikleri önlemek için gevşek devlet kasları düzeltmek için tercih edilebilir sürece kas öngörülemeyen sonuçlar üretebilir ön-germe girişimleri dikkat edilmelidir Önceden germe işlemi 8,9. Bu tür özel ölçümler de dahil olmak üzere pek çok b (gerekli değildir olduğu için, kaslarınklinik amaçlar için gerçekleştirilen iopsies), kas-geriliminin önceden harcanan çabalar genellikle yapılmaz, ve kas morfolojisi üzerinde temel etkisi kas sarkomerlerin düzgün olmayan bir aralıklarıdır.
Bu yazıda konjenital kas hastalıkları alanında testlerin performansı için SOP sağlamak için bir dizi ilk temsil eder ve rutin hücresel, moleküler, fonksiyonel, fizyolojik gerçekleştirmek doğuştan kas hastalığı alanında 20 yılı uzmanların çabalarını temsil eder ve patolojik araştırma. Yayınlanan SOP'ların bir dizi önümüzdeki yıl hazır olacak ve her biri için gerekli protokoller ve uygun yayın formatları bu SOP çabanın amacı sağlamaktır Washington DC 2013 yılının Nisan ayında düzenlenen bir Konjenital Kası Hastalıkları Konsorsiyumu Çalıştayı ele alındı 1) m olarak alanında kullanılan uygulamaları ve uç noktaları standardize doğuştan kas hastalığı alanında gerekli test ve numunelerin analizi için bir yol haritasımümkün gibi uch 2) bizim alanda yeni araştırmacılar için standart uygulamaları eğitimi sağlamak. Biz bu kaynaklar bizim altında çalışılan alana yeni araştırmacıların girişini kolaylaştırmak ve böylece yapılabilir araştırmanın kapsamını artıracak inanıyoruz. Ayrıca, uygulamaların bir standardizasyon çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak ve klinik öncesi ve klinik denemeler planlarken ve gerçekleştirirken, son noktaları tanımlamak için son derece yararlı olacaktır.
Bu makalenin ana odak çalışmaları çeşitli için uygun donma ve doku hazırlanması ile ilgili iken, bizim işbirlikçi grup da kas örneklerinin patolojik inceleme için yararlı bitiş noktaları tartışıldı. Şu anda, orada patolojik analizi yaparken almaya yaklaşımı hiçbir resmi uzlaşma olduğunu ve farklı çalışmalar çeşitli ilgili her hastalık için önceki yayınlarda yeni bulgular ilişki yapılmaktadır. Böylece, biz yararlı olacağını düşündümkas patoloji karakterizasyonu patolojik uç noktalarının planlanması için bazı genel kurallar öneriyoruz. Önceki bir çalışmada, patoloji miktarının için, önemli bir düşünce) 1'e fiber boyutu ölçüm yöntemi konulmalıdır, 2) lif türüne özgü anormalliklerin ya da tedavi etkilerinin olasılığı, 3) anormallikleri veya etkilerinin olasılığı sınırlıdır ki Bireysel kaslara ve 4) çalışma altındaki hastalık için karakteristik olan patolojik bulgular miktarının belirlenmesi için bir stratejidir. Fiber boy en çalışmaları için gerekli bir uç nokta olduğunu, ve ne yazık ki sayısal nasıl geniş bir varyasyon vardır. Birçok çalışma, özel görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan otomatik ölçümü yöntemleri kullanarak bu sonuçları rapor, ancak bu programların çok bu otomatik ölçümler hatalı hale getirebilir (örneğin lifler daire veya elips olduğunu varsayarak gibi) kısayolları alın. Bu otomatik programlar kendi ölçümleri b yapmak nasıl anlamak için gerekliefore ölçümlerde güven sahip ve biz kağıt yöntemleri bu bilgileri içerecek şekilde araştırmacıları teşvik ediyoruz. Ayrıca, fiber boyutu belirtmek için kullanılan özel ölçüm son derece değişkendir, ve bazı ölçümler diğerleri 10,11 tercih edilir. Fiber ebadı genel olarak kullanılan bir ölçüm fizyolojik çalışmalar yapmak araştırmacılar aletleri kullanılarak elde CSA ölçümlerine sonuçları standart oldukları için, bir elyaf kesit alanı (CSA) 'dir. CSA ölçümler doğru mükemmel enine kesitlerinde fiber boyutunu yansıtmak iken, ne yazık ki, onlar (boyuna veya eğimli-kesitli lifler yapay yüksek CSA ölçümler olacak ölçüde) lif yönelim yoğun bağımlı olan ve fiber boyutu dolayısıyla ideal değildir ölçümlerdir. Lif kesit alanının daha az bağımlıdır fiber ebadı tercih edilen bir ölçüm th ölçümüdür minimum Feret çapı (MinFeret çap), olduğukas hücresi 12 e küçük çapı. Bu ölçüm lif yönelim sadece biraz bağlıdır ve genellikle lif ölçümü için klinik altın standart olduğunu ve araştırmacılar bu tekniğin kullanılması doğru hareket için teşvik edilir. Bu ölçümler genellikle CSA ölçümleri 13 üretir aynı yazılımı kullanılarak yapılacaktır ve ayrıca elle ölçmek için basit olabilir. Lif tipi, belirli kas, ve belirli bir hastalığa bağlı patolojik bulgular bağlamında göre patolojik verileri değerlendirerek göre, bu sadece bir çalışma, planlama aşamasında dikkate alınmalıdır az tartışmalı konulardır. Fiber tipi immünohistokimyasal veya ATPaz boyama kullanılarak değerlendirilebilir, ama belli kasları ve hayvan türlerinin bu fiber tiplerinin özel karışımlar (böylece farklı beklentileri gerektiren ve stratejileri test) olduğunu dikkate almak yararlı olur. Kas spesifik patolojik tutulum veya tedavi etkinliğiortaya çıkar ve toplam kas ağırlığı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında patolojik değerlendirmek için kas karar vermeden önce hastalığın heterojenlik derecesini belirlemek için kullanılabilir olabilir. Son olarak, bu da birçok kas hastalıkları (örneğin, nemaline miyopati nemaline çubuklar gibi) belirli bir patolojik anormallikler 14,15 ile ilişkili olduğu bilinmektedir ve bu yüzden, bu anormallikler, bir elyaf tipi ya da kas bulunan olmadığını dikkate almak da yararlıdır özgü dağılım analizi 16,17 gerçekleştirilmesi. Biz kas değerlendirilmesi için standartların esnek olmayan bir dizi teklif yok ederken Genel olarak, biz bu konuları önceden herhangi bir iskelet kası hastalığı patolojik çalışmaların performansının kabul edilmesi gerektiğine inanıyorum.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
