الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
العضلات والهيكل العظمي هو نسيج فريد من نوعه بسبب هيكلها وظيفة، الأمر الذي يتطلب بروتوكولات محددة لجمع الأنسجة للحصول على أفضل النتائج من التقييمات الوظيفية، والخلوية والجزيئية والمرضية. نظرا لدقة بعض التشوهات المرضية شهدت اضطرابات في العضلات الخلقي وإمكانية التثبيت لتتداخل مع الاعتراف من هذه الميزات، وتقييم المرضية من العضلات المجمدة هو أفضل من العضلات ثابتة عند تقييم العضلات والهيكل العظمي للمرض في العضلات الخلقي. بالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على إنتاج التحف تجميد شديد في العضلات يتطلب احتياطات معينة عند تجميد العضلات والهيكل العظمي للفحص النسيجي التي لا تستخدم عادة عند تجميد الأنسجة الأخرى. يصف هذا المخطوط بروتوكول للتجميد السريع للعضلات الهيكل العظمي باستخدام نظير البنتان (2-methylbutane) تبريد مع النيتروجين السائل للحفاظ على مورفولوجيا الأمثل العضلات والهيكل العظمي. هذا الإجراء هو أيضا فعالة لوreezing الأنسجة المعدة للدراسات التعبير الجيني أو البروتين. علاوة على ذلك، قمنا بدمج بروتوكول تجميد لدينا في إجراء أوسع يصف أيضا الأساليب المفضلة لفرز المدى القصير من الأنسجة ل(1) الدراسات الفنية واحد من الألياف و(2) زراعة الخلايا myoblast، مع التركيز على الحد الأدنى من الجهد اللازم لجمع الأنسجة ونقلها إلى البحوث أو مرجع مختبرات متخصصة لاستكمال هذه الدراسات. عموما، يوفر هذا المخطوط الخطوط العريضة لكيفية الأنسجة الطازجة يمكن توزيعها على نحو فعال لمجموعة متنوعة من الدراسات المظهري ويوفر إجراءات التشغيل القياسية (إجراءات العمل الموحدة) للدراسات المرضية المتعلقة بأمراض العضلات الخلقي وبالتالي.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
العضلات والهيكل العظمي هو نسيج هيكليا وفريدة من نوعها وظيفيا، والتي تكون ضرورية للسماح للتقييم الأمثل للمعلمات الهيكلية والوظيفية إجراءات إعداد المتخصصة. بينما مجموعة متنوعة من الأنسجة يتم تجميد عادة للدراسات باثولوجية في سياقات السريرية والبحثية، وبروتوكولات لتجميد الأنسجة غير العضلات عادة ما تنطوي على الانغماس الكلي للأنسجة في OCT قبل التجميد. كما هو مبين في الشكل (3)، ومثل هذا البروتوكول هو مناسبة لتقييم المرضية من الهيكل العظمي والعضلات وحتى الآن يشبه ما يكفي لبروتوكول الموصوفة هنا أن هذا هو خطأ شيوعا التي تواجهها. الهدف من هذه الورقة هو لتوفير بروتوكول اضحة للتعامل السليم من العضلات لتجنب المشاكل من هذا القبيل. كما تم تجميع المشورة بشأن التعامل السليم مع العضلات لالفسيولوجية خارج الموقع والدراسات الخلوية وذلك في محاولة لتسهيل الحصول على البيانات عالية الجودة من خلال المختبرات الأساسية خارج في حالات عرجإعادة الدراسات في الموقع ليست الأفضل أو ممكن.
كما لوحظ في هذا البروتوكول، والعناصر التي لا غنى عنها على الاطلاق في تجهيز المناسبة من العضلات للدراسات المرضية تشمل تقليل محتوى الماء من الأنسجة، وخفض درجة الحرارة التي يتم تجميد العضلات، وزيادة السرعة التي يتم تحقيق التجميد. والرطوبة الزائدة داخل الأنسجة أو بطء المفرط للعملية التجميد (التي تنتجها درجات الحرارة غير كافية أو عن طريق عدم وجود اتصال مباشر بين وكيل وتجميد الأنسجة، كما واجه مع النيتروجين السائل) يؤدي إلى تجميد الأعمال الفنية التي يمكن أن يضعف التحليل المرضية. كما يوفر أكتوبر مصدرا إضافيا للرطوبة الأنسجة، والعديد من المختبرات استخدام مواد لاصقة أخرى مثل صمغ الكثيراء باعتبارها الركيزة التضمين. حتى في الحالات التي يتم تنفيذ تجميد مناسب، وينبغي الحرص على تجنب العينات في وقت لاحق ذوبان عن طريق الخطأ من خلال الاتصال مع حاويات أو الصكوك RT.وبالتالي، يتطلب عملية تجميد ناجحة درجة من التخطيط الذي يتضمن ما قبل تقشعر لها الأبدان من جميع الصكوك وحاويات لاستخدامها. عندما واجهت تجميد التحف، هناك طريقة وصفها هنا لاستعادة الأنسجة التي هي كافية لمعظم التقييمات المرضية. ومع ذلك، هذه الدورة تجميد / الذوبان لا تقدم الأنسجة والكمال لديه القدرة على يضعف الدراسات الجزيئية أو الأنزيمية أخرى من الأنسجة (بالإضافة إلى الوقت اللازم لإعادة تجميد الأنسجة)، وذلك باستخدام الممارسات التجميد الأولي المناسب هو الأفضل إلى حد كبير . في الحالات التي واجهت تجميد قطعة أثرية على الأنسجة ما قبل المجمدة، ومع ذلك، فإن تقنية الموضحة في هذه الوثيقة يمكن أن تكون مفيدة للغاية.
التثبيت ومعالجة الأنسجة لEM يمكن أن تقدم تحديات تقنية محددة تتطلب التخطيط المسبق لجمع الأنسجة. الخطأ الأكثر شيوعا عند جمع العينات للEM ينطوي على استخدام شظايا الأنسجة التي هي سميكة جدا لglutaraldehydه لاختراق. كما غلوتارالدهيد تخترق فقط حوالي 0.1 سم في الأنسجة العضلية من معين السطح، والرعاية التي ينبغي اتخاذها لضمان أن بعد واحد من العينات EM ليس أكثر سمكا من 0.2 سم. بالإضافة إلى ذلك، كما EM هو وسيلة ممتازة لتقييم مباشر على جهاز مقلص، وضعت بعض المحققين استراتيجيات لمرحلة ما قبل أو ما قبل التوتر تمتد العضلات قبل التثبيت للسماح للقياس عناصر مقلص في التوتر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ليس هناك بروتوكول قياسي لمرحلة ما قبل التوتير، ولكن تم وصفها استراتيجيتين لفترة وجيزة في هذا البروتوكول. تجدر الإشارة إلى أن محاولات التوتير قبل العضلات يمكن أن تنتج نتائج غير متوقعة ما لم يتم القيام به بطريقة محددة جدا، وأنه قد يكون من الأفضل لإصلاح العضلات في حالة الركود لمنع التغييرات مصطنعة في طول قسيم عضلي خلال غير القياسية قبل التوتير الداخلي 8،9. للعضلات التي مثل مقاييس محددة ليست ضرورية (بما في ذلك معظم بiopsies يؤديها لأغراض سريرية)، وعموما لا تبذل الجهود إلى ما قبل التوتر في العضلات، والتأثير الرئيسي على التشكل العضلات هو تباعد غير موحدة من sarcomeres في العضلات.
تمثل هذه الورقة الأولى في سلسلة لتوفير إجراءات العمل الموحدة لأداء الاختبارات في مجال أمراض العضلات الخلقية، وأنها تمثل جهود أكثر من 20 خبيرا في مجال الخلقية مرض في العضلات التي تؤدي بشكل روتيني الخلوية والجزيئية والوظيفية والفسيولوجية، و البحث المرضية. وسيتم إجراء مجموعة من إجراءات العمل الموحدة المنشورة المتاحة خلال السنة المقبلة، وتمت مناقشة البروتوكولات اللازمة والصيغ المناسبة لنشر كل في العضلات الخلقي ورشة عمل مرض اتحاد الذي عقد في نيسان من عام 2013 في واشنطن العاصمة والهدف من هذا الجهد هو توفير SOP خارطة طريق لاختبار اللازمة وتحليل العينات في مجال أمراض العضلات الخلقي ل1) توحيد الممارسات والنهاية المستخدمة في مجال عملنا كما ماوك ممكن، و2) توفير التعليم على الممارسات القياسية الجديدة للباحثين في مجال عملنا. ونحن نعتقد أن هذه الموارد سوف تسهيل دخول المحققين جديدة في مجال عملنا تحت المدروسة وبالتالي تحسين نطاق البحوث التي يمكن القيام بها. بالإضافة إلى ذلك، فإن توحيد الممارسات تكون مفيدة للغاية لمقارنة البيانات عبر الدراسات وتحديد نقاط النهاية عند تخطيط وتنفيذ التجارب قبل السريرية والسريرية.
في حين يرتبط المحور الرئيسي لهذه المقالة لتجميد وإعداد الأنسجة المناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات، ناقش مجموعة تعاونية لدينا أيضا نقاط النهاية مفيدة لتحليل العينات المرضية من العضلات. في الوقت الحاضر، لا يوجد إجماع رسمي على النهج التي يجب اتخاذها عند إجراء تحليل المرضية، ويتم تنفيذ مجموعة متنوعة من الدراسات المختلفة لربط الاكتشافات الجديدة إلى المنشورات السابقة لكل مرض منها. وهكذا، كنا نظن أنه سيكون من المفيداقتراح بعض المبادئ التوجيهية العامة لتخطيط النهاية المرضية في العضلات الأمراض التوصيف. قبل قياس علم الأمراض في دراسة، ينبغي وضع الفكر كبيرة في 1) طريقة قياس حجم الألياف، 2) إمكانية تشوهات الألياف من نوع معين أو آثار العلاج، 3) إمكانية تشوهات أو آثار التي يتم تقييد الى العضلات الفردية، و4) استراتيجية لقياس النتائج المرضية التي هي سمة لهذا المرض قيد الدراسة. حجم الألياف هو نقطة النهاية ضرورية لمعظم الدراسات، وللأسف هناك تباين واسعة في كيفية كميا ذلك. تقرير العديد من الدراسات هذه النتائج باستخدام أساليب القياس الكمي الآلي التي تقدمها برامج التصوير الملكية، ولكن العديد من هذه البرامج تأخذ الاختصارات (مثل افتراض أن الألياف هي الدوائر أو الحذف) التي يمكن أن تجعل هذه القياسات الآلية غير دقيقة. فمن الضروري أن نفهم كيف جعل هذه البرامج التي تعمل تلقائيا على قياسات بefore وجود الثقة في القياسات، ونحن نشجع المحققين لإدراج هذه التفاصيل في وسائل الورق. بالإضافة إلى ذلك، فإن قياس محددة تستخدم للدلالة على حجم الألياف هو متغير للغاية، وبعض القياسات هي الأفضل للآخرين 10،11. A القياس المستخدمة عادة من حجم الألياف الألياف هي منطقة مستعرضة (CSA)، وخصوصا بسبب المحققين إجراء دراسات فسيولوجية توحيد نتائجها لقياسات CSA تم الحصول عليها باستخدام أدواتها. للأسف، في حين أن وكالة الفضاء الكندية القياسات يمكن أن تعكس بدقة حجم الألياف في قطاعات عرضية مثالية، فهي تعتمد بشكل مكثف على اتجاه الألياف (إلى حد أن الألياف الطولية أو مقطوع بشكل غير مباشر، وسوف يكون قياسات CSA عالية بشكل مصطنع) والقياسات هي بالتالي ليست مثالية لحجم الألياف. والقياس الأفضل من حجم الألياف التي هي أقل اعتمادا على الألياف منطقة مستعرضة هو الحد الأدنى لقطر في فيريه (MinFeret قطر)، والذي هو قياس اله قطرها طفيفة في الخلية العضلات 12. هذا القياس هو فقط يعتمد قليلا على اتجاه الألياف وبشكل عام، هي السريرية الذهب القياسية لقياس الألياف، ويتم تشجيع المحققين على التحرك نحو استخدام هذه التقنية. يمكن في كثير من الأحيان هذه القياسات يتم باستخدام نفس البرنامج الذي يولد القياسات CSA 13، وتكون أيضا واضحة لقياس يدويا. فيما يتعلق بتقييم البيانات المرضية وفقا لنوع الألياف، محددة من العضلات، وفي سياق النتائج المرضية المتعلقة بأمراض محددة، وهذه هي القضايا التي يجب أن أقل إثارة للجدل فقط أن ينظر أثناء التخطيط للدراسة. نوع من الألياف يمكن تقييمها باستخدام تلطيخ المناعى أو أتباز، ولكن من المفيد أن نعتبر أن عضلات معينة وأنواع الحيوانات لديها خليط من أنواع معينة من الألياف هذه (مما يستلزم توقعات مختلفة واختبار الاستراتيجيات). العضلات المشاركة المرضية محددة أو فعالية العلاجيمكن أن يحدث، ووزن العضلات مجموع مقارنة مع الضوابط يمكن أن تستخدم لتحديد درجة عدم التجانس من المرض قبل البت في العضلات لتقييم مرضي. أخيرا، فمن المعروف جيدا أن العديد من الأمراض العضلات ترتبط مع تشوهات مرضية محددة (مثل قضبان خيطي في اعتلال عضلي خيطي) 14،15، ولذا فمن المفيد أيضا أن ينظر فيما إذا وجدت هذه التشوهات في الألياف من نوع أو العضلات توزيع محددة عند إجراء تحليل 16،17. الكلي، في حين أننا لا نقترح مجموعة مرنة من معايير لتقييم العضلات، ونحن لا نعتقد أن هذه المسائل ينبغي النظر قبل أداء الدراسات المرضية في أي مرض في العضلات والهيكل العظمي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
