組織トリアージや骨格筋疾患のモデルのために凍結
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
骨格筋は、機能的な細胞、分子、および病理学的評価から最適な結果を得るために、組織収集のための特定のプロトコルを必要とするため、その構造および機能のユニークな組織である。先天性の筋疾患の骨格筋を評価するときのための先天性筋疾患で見られるいくつかの病理学的な異常の繊細さと、これらの機能の認識を妨害する固定用の電位に、凍結された筋肉の病理学的評価は、固定され、筋肉よりも好ましい。他の組織を凍結する際に一般的に使用されていない組織学的検査のために骨格筋を凍結した場合に加えて、筋肉に重度の凍結の成果物を生成する可能性が具体的な予防措置が必要です。この原稿は、最適な骨格筋の形態を維持するために、液体窒素で冷却したイソペンタン（2 – メチルブタン）を用いて、骨格筋の急速凍結のためのプロトコルを記載している。この手順は、fのに有効である遺伝的またはタンパク質発現の研究を目的とした組織をreezing。さらに、我々は、収集する必要が最小限の努力に焦点を当て、また、（1）単繊維の機能研究と（2）筋芽細胞培養のための組織の短期トリアージのための好ましい方法を説明して、より広いプロシージャに私たちの凍結プロトコルを統合したこれらの研究を完了するために、専門の研究や参照ラボにそれを組織し、輸送する。全体的に、この原稿は、新鮮な組織が効果的に表現型の様々な研究のために配布することができる方法の概要を提供し、それによって先天性の筋疾患に関連病理学的研究のための標準作業手順書（SOP）を提供します。
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
骨格筋は、構造的および機能的にユニークな組織であり、特殊な製造手順は、構造的および機能的パラメータの最適評価を可能にするために必要である。種々の組織は、一般的に、臨床と研究の文脈での病理学的研究のために凍結されていますが、非筋肉組織のための凍結プロトコルは、通常、凍結前に10月中の組織の総浸漬することを含む。 図3に示すように、このようなプロトコルは、骨格筋の病理学的評価には適していないと、まだ、これは一般的に発生するエラーであることをここに記述されたプロトコルに十分類似しています。この論文の目的は、このような問題を回避するために、筋肉を適切に処理するための簡単なプロトコルを提供することです。アドバイスもWHE例に外側コア研究所による高品質なデータの取得を容易にする目的で、オフサイトの生理学的および細胞の研究のための筋肉の適切な取り扱いにコンパイルされている再オンサイト研究は望ましいか、可能ではありません。
このプロトコルで述べたように、病理学的研究のために筋肉の適切なプロセシングに必要不可欠な要素は、組織の水分含有量を最小化する筋肉が凍結する温度を低下させる、凍結が達成される速度を増加させることが挙げられる。 （液体窒素で遭遇するように、不十分な温度によって、または凝固剤と組織との間の直接接触の欠如によって生成される）組織または凍結プロセスの過剰な遅内の過剰な水分は、病理学的分析が損なわれる可能性がアーチファクトを凍結につながる。 10月には、組織の水分の追加のソースを提供するので、多くの研究室は、埋基質としてトラガカントガムのような他の接着剤を使用しています。凍結が適切に行われている場合であっても、介護はその後、誤って、RTコンテナや楽器との接触を介して標本を解凍しないように注意する必要があります。したがって、成功した凍結工程は、使用するすべての機器および容器の予備冷却を含む計画の程度を必要とする。凍結アーティファクトが発生した場合、ほとんどの病理学的評価のために十分である組織の回復のためにここで説明する方法がある。しかし、この凍結/解凍サイクルは完璧な組織像を提供し、（再凍結組織するのに必要な時間に加えて）組織の他の分子または酵素の研究を損なう可能性があるので、適切な初期凍結プラクティスを使用することは非常に望ましいされません。凍結アーティファクトが予め凍結組織に遭遇した場合において、しかしながら、本明細書に記載の技術は非常に有用であり得る。
EMのための組織の固定および処理前組織収集に計画して必要な特定の技術的な課題を提供することができます。 EMのための検体を採取する最も一般的なエラーは、グルタルアルデヒドのために厚すぎる組織片の使用を含む浸透するE。グルタルアルデヒドのみ与えられた表面から筋肉組織に約0.1センチメートルを貫通するように、お手入れは、EMのサンプルの1次元は0.2センチメートルよりも厚くなっていないように注意する必要があります。 EMに直接収縮装置を評価する優れた手段であるとしてさらに、一部の研究者は、戦略を開発した筋肉固定前に事前張力またはプレストレッチ生理的に適切な張力で収縮要素の測定を可能にする。そこに事前緊張のための標準プロトコルはありませんが、2つの戦略を簡単に、このプロトコルで説明されています。それは彼らが非常に特殊な方法で行われており、それは非標準を通じて筋節の長さの人為的な変更を防止するたるみの状態で筋肉を固定することが好ましいかもしれない限り、筋肉が予測できない結果を生成することができます事前にテンションを試みることを注意すべきであるプレテンション手順8,9。ほとんどのBを含む、このような特定の測定が必要でされていない筋肉（のための臨床目的のために行わiopsies）は、筋張力を事前にするための努力は、一般的に行われず、筋肉の形態の主な効果は、筋肉中の筋節の不均一な間隔である。
本論文では、先天性の筋疾患の分野での試験の実施のためのSOPを提供するシリーズの最初を表しており、それが日常的に携帯電話、分子、機能的、生理的に実行する先天性の筋疾患分野で20以上の専門家の努力を表しており、病理学的研究。公開されたSOPの範囲は、今後一年間利用できるようになり、それぞれに必要なプロトコルと適切な出版形式はこのSOP努力の目標は、提供することを目的とするワシントンDCで2013年4月に開催された先天性筋疾患コンソーシアムワークショップで議論された1）mと私たちの分野で使用される慣行とエンドポイントを標準化する先天性の筋疾患分野での必要なテストや標本の分析のためのロードマップできるだけUCH、および2）私たちのフィールドに、新しい研究者のための標準的な慣行上の命令を提供する。私たちは、これらのリソースが私たちの下で研究されたフィールドに新しい研究者の参入を容易にし、このように行うことができる研究の範囲を向上させると確信しています。さらに、慣行の標準化は研究間でデータを比較すると、前臨床および臨床試験を計画し、実行するときにエンドポイントを識別することは非常に参考になります。
この記事の主な焦点は、様々な研究のための適切な凍結組織の準備に関連している一方で、私たちの共同のグループはまた、筋肉標本の病理学的解析に有用なエンドポイントを議論した。現時点では、そこに病理学的解析を実行するときに実行するアプローチの公式合意がなく、異なる様々な研究は、それぞれの疾患のために前に出版物に新たな知見を関連付けるために実行されます。したがって、我々はそれが有用であると考え筋肉の病理学の特性評価における病理学的エンドポイントの計画のための一般的なガイドラインを提案する。研究で病理学を定量化する前に、かなりの思考は1に入れられるべきである）繊維サイズ測定方法、ファイバ型特有の異常や治療効果の2）の可能性、3）異常や影響の可能性が制限される個々の筋肉へ、及び4）研究中の疾患に特徴的な病理学的所見を定量化するための戦略。繊維サイズはほとんどの研究のために必要なエンドポイントであり、残念ながらそれを定量する方法で豊富なバリエーションがあります。多くの研究では、独自の画像処理ソフトウェアが提供する自動化された定量法を用いてこれらの結果を報告しますが、これらのプログラムの多くは、これらの自動化された測定値が不正確にレンダリングすることができます（このような繊維は、円または楕円であることを前提として）ショートカットを取る。それは、これらの自動化されたプログラムが、その測定値Bを作る方法を理解することが必要であるお使いになる前の測定値の信頼性を持つ、我々は紙の方法でこれらの詳細を含めることが研究者を奨励する。さらに、繊維サイ ズを表すために使用される特定の測定は非常に可変であり、一部の測定値は、他の10,11よりも好ましい。線維サイズの一般的に使用される測定は、生理学的研究を行う研究者が自分の楽器を使用して得られたCSAの測定を、その結果を標準化するため、特に、繊維断面積（CSA）である。 CSAの測定が正確に完璧な横断面の繊維の大きさを反映することができますが、残念ながら、彼らは広範囲に（縦または斜めに切断した繊維は、人為的に高いCSAの測定値を持つ程度に）、繊維配向に依存しているため、繊維サイズのための理想的な測定ではありません。繊維断面積にあまり依存しない繊維径の好ましい測定は、目の測定値である最小フェレ径（MinFeret直径）である筋細胞12に小径の電子。この測定は、繊維配向にわずかに依存しており、一般的には、繊維の測定のための臨床ゴールドスタンダードであり、研究者は、この技術の使用に向けて移動することをお勧めします。これらの測定は、多くの場合、CSA測定値13を生成する同じソフトウェアを使用して作製され、また、手動で測定することが簡単であることができる。繊維の種類、特定の筋肉、および特定の疾患に関連する病理所見との関連においてに従って病理学的データを評価に関しては、これらは、単に研究の計画時に考慮されるべきであるより少なく論争の問題です。繊維タイプは、免疫組織化学またはATPアーゼ染色を用いて評価することができるが、それは、特定の筋肉や動物種は、これらの繊維タイプの特定の混合物（したがって、異なる期待とテスト戦略を必要とする）があることを考慮することが有用である。筋特異的病理学的関与や治療効果発生し、対照と比較して総筋肉量が病理学的に評価するために、筋肉を決定する前に、疾患の異質性の程度を同定するために用いることができる。最後に、ウェル多くの筋疾患は（例えば、ネマリンミオパチーにおけるネマリン棒のような）特定の病的異常14,15に関連していることが知られているので、それは、これらの異常は、ファイバ型又は筋肉内に見出されるかどうかを検討することも有用である特異的分布の解析16,17を実施する。我々は筋肉の評価のための基準の柔軟性のないセットを提案していないながら、全体的に、我々はこれらの問題は前に任意の骨格筋疾患における病理学的研究の実施に考慮されるべきであると信じています。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
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