Ткань Сортировка и морозильные моделей скелетных мышечных заболеваний

Скелетных мышц является структурно и функционально уникальной ткани, и специализированные процедуры подготовки необходимы, чтобы позволить оптимальную оценку структурных и функциональных параметров. В то время как различные ткани, как правило, в замороженном патологических исследований в клинических и исследовательских контекстах, протоколы замораживания для не-мышечных тканей, как правило, связаны с полного погружения ткани в октябре перед замораживанием. Как показано на фиг.3, такой протокол не подходит для патологического оценки скелетных мышц и еще достаточно похож на протокол, описанный здесь, что это часто встречается ошибка. Целью данной работы является создание простой протокол для надлежащего обращения с мышцы, чтобы избежать проблем, как это. Консультации также был составлен на соответствующую обработки мышцы за пределы участка физиологических и клеточных исследований, с тем чтобы облегчить приобретение высококачественных данных по внешним основных лабораторий в случаях Wheповторно на месте исследования не являются предпочтительными или возможно.

Как отмечено в этом протоколе элементы, которые являются абсолютно необходимым в надлежащем обработки мышцы для патологических исследований включают минимизации содержание воды в тканях, снижение температуры, при которой мышца заморожены, и увеличить скорость, при которой замораживание достигается. Повышенная влажность в ткани или чрезмерной медлительности процесса замораживания (производства недостаточных температурах или отсутствием прямого контакта между агентом замерзания и ткани, как встречается с жидким азотом) приведет к замораживанию артефактов, которые могут повлиять на патологический анализ. Как октября обеспечивает дополнительный источник увлажнением тканей, многие лаборатории использовать другие клеи, как трагакантовая как вложения подложки. Даже в тех случаях, когда замораживание выполняется надлежащим образом, следует позаботиться, чтобы избежать впоследствии случайно оттаивания образцов при контакте с RT контейнерах или инструментов.Таким образом, успешный процесс замораживания требует определенной планирования, которая включает предварительно охлаждение всех инструментов и контейнеров, которые будут использоваться. Когда артефакты морозильные встречаются, существует метод, описанный здесь для восстановления тканей, которое является достаточным для большинства патологических оценок. Однако это замораживания / оттаивания не предлагает идеальный гистологию и имеет потенциал, чтобы нарушить другие молекулярные или ферментативные исследования ткани (в дополнение к времени, необходимого для повторного замораживания ткани), так с использованием соответствующих исходных практики замораживания является гораздо предпочтительнее . В случаях, когда замораживание артефакт, возникающих на предварительно замороженной ткани, однако, способ, описанный здесь, может быть чрезвычайно полезным.

Фиксация и обработка ткани для ЭМ может предложить конкретные технические проблемы, которые требуют планирования до сбора ткани. При сборе образцов для EM наиболее распространенная ошибка предполагает использование тканевых фрагментов, которые являются слишком толстым для glutaraldehydе проникнуть. Как глютаральдегид только проникает около 0,1 см в мышечную ткань от заданной поверхности, следует позаботиться, чтобы убедиться, что одно измерение образцов ЭМ является не толще 0,2 см. Кроме того, как EM является отличным средством непосредственно оценки сократительной аппарата, некоторые исследователи разработали стратегии для предварительного натяжения или предварительного натяжения мышц до фиксации, чтобы позволить измерение сократительных элементов в физиологически соответствующего напряжения. Там нет стандартного протокола для предварительного натяжения, но две стратегии кратко описаны в этом протоколе. Следует отметить, что попытки предварительного натяжения мышц может привести к непредсказуемым результатам, если они не сделаны в очень специфическим образом, и это может быть предпочтительным, чтобы исправить мышцы в ослабленном состоянии, чтобы предотвратить артефактом изменения длины саркомера через нестандартные предварительного натяжения процедура ^8,9. Для мышц, в которых такие специфические измерения не нужны (в том числе большей Ъiopsies выполненные для клинических целей), усилия по предварительному натяжению мышц, как правило, не производится, и основной эффект на мышечную морфологии является неравномерное расстояние саркомеров в мышцах.

Эта статья представляет собой первый в серии, чтобы обеспечить СОП для проведения испытаний в области врожденного заболевания мышц, и это являет собой результат труда более чем 20 специалистов в врожденной мышечной области заболевания, которые обычно выполняют клеточном, молекулярном, функциональный, физиологические и патологическое исследование. Диапазон опубликованных СОП будут доступны в течение следующего года, и были обсуждены необходимые протоколы и соответствующие форматы публикации для каждого при врожденном мышц Болезнь Консорциум семинара, проведенного в апреле 2013 года в Вашингтоне, округ Колумбия Цель этой SOP усилий является обеспечение дорожная карта необходимого тестирования и анализа образцов в врожденной области заболевания мышц, чтобы 1) стандартизации практики и конечные точки, используемые в нашей области, как муч насколько возможно, и 2) обеспечить обучение на стандартной практикой для новых исследователей в нашей области. Мы считаем, что эти ресурсы будут способствовать появлению новых исследователей в нашей под изученный поле и тем самым улучшить сферу исследований, которые могут быть выполнены. Кроме того, стандартизация практики будет чрезвычайно полезно сравнить данные по исследованиям и определить конечные точки при планировании и выполнении доклинические и клинические испытания.

В то время как основное внимание в этой статье связано с соответствующей замораживания и приготовления ткани для различных исследований, наша совместная группа также обсудила полезные конечные точки для патологического анализа мышечных образцов. В настоящее время нет официального консенсуса на подходе принять при выполнении патологический анализ, и множество различных исследований выполнено связать новые данные с предыдущими публикаций для каждого соответствующего заболевания. Таким образом, мы думали, что было бы полезно, чтобыпредложить некоторые общие рекомендации по планированию патологических конечных точек в мышечной патологии характеристики. До количественного патологию в исследовании, значительная мысль должна быть введена в 1) метод измерения размера волокно, 2) возможность аномалий волоконно-типоспецифических или эффектов лечения, 3) возможность аномалий или эффектов, которые ограничены в отдельных мышц, и 4) стратегия для количественного патологических, которые характерны для этой болезни в исследовании. Размер волокна является необходимым конечная точка для большинства исследований, и, к сожалению, весьма обширен изменение в том, как она количественно. Многие исследования показывают эти результаты, используя автоматизированные методы количественной предоставляемые проприетарного программного обеспечения визуализации, но многие из этих программ срезать углы (например, если предположить, что волокна представляют собой окружности или эллипсы), которые могут сделать эти автоматизированные измерения неточны. Надо понять, как эти автоматизированные программы делают их измерения бEfore имея уверенность в измерениях, и мы призываем следователей включить эти данные в методах бумаги. Кроме того, удельный измерение используется для обозначения размера волокна является чрезвычайно переменным, и некоторые измерения предпочтительнее других ^10,11. Обычно используется измерение размера волокон является площадь поперечного сечения волокна (CSA), в частности, потому, что исследователи, выполняющие физиологических исследований стандартизировать свои результаты измерений, полученных с помощью CSA свои инструменты. К сожалению, в то время как измерения CSA может точно отражать размер волокна в идеальных секций поперечными, они широко в зависимости от ориентации волокон (в том случае, продольные или наклонно-секционные слои будут иметь искусственно завышенные размеры CSA) и, таким образом, не идеальными для измерения размера волокон. Предпочтительным измерение размера волокон, которые меньше зависит от волокна площади поперечного сечения является минимальной диаметр Фере (диаметр MinFeret), который является измерение гое малый диаметр в мышечной клетке ^12. Это измерение слабо зависит от ориентации волокон и, как правило, клиническая золотым стандартом для измерения волокна, и следователи поощряются двигаться к использованию этой техники. Эти измерения часто можно сделать с помощью того же программного обеспечения, который генерирует измерений CSA ^13, и также просто для измерения вручную. Что касается оценки патологических данных в зависимости от типа волокна, определенной мышцы, и в контексте патологических, связанных с конкретным заболеванием, они менее спорные вопросы, которые должны просто быть рассмотрены при планировании исследования. Тип волокна можно оценить с помощью иммуногистохимического или АТФазную окрашивание, но это полезно рассмотреть, что конкретные мышцы и животных имеют особые смеси этих типов волокон (что требует разные ожидания и тестирование стратегии). Мышцы конкретных патологических участие или эффективность леченияможет иметь место, и общий вес мышц по сравнению с контрольной может быть использован, чтобы идентифицировать степень гетерогенности заболевания, прежде чем решить на мышцы к патологически оценки. Наконец, хорошо известно, что многие заболевания мышц, связанные с конкретными патологических отклонений (например, немалиновой стержней в немалиновой миопатия) ^14,15, и поэтому он также полезно рассмотреть, являются ли эти нарушения обнаружены в волоконно-типа или мышцы конкретных распределение при выполнении анализа ^16,17. В целом, в то время как мы не предлагаем негибкий набор стандартов для оценки мышцы, мы считаем, что эти вопросы должны рассматриваться до исполнения патологических исследований в любой скелетной мышечных заболеваний.