Tissue Triage e Freezer per i modelli di malattia muscolare scheletrico
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
Il muscolo scheletrico è un tessuto unico per la sua struttura e funzione, che richiede protocolli per la raccolta dei tessuti per ottenere risultati ottimali da valutazioni funzionali, cellulari, molecolari, e patologici. A causa della sottigliezza di alcune alterazioni patologiche viste nei disturbi muscolari congenite e il potenziale di fissazione di interferire con il riconoscimento di queste caratteristiche, la valutazione patologica del muscolo congelato è preferibile muscolare fisso nel valutare muscolo scheletrico per malattia muscolare congenita. Inoltre, il potenziale di produrre gravi artefatti congelamento nel muscolo richiede precauzioni specifiche per la congelazione muscolo scheletrico per l'esame istologico che non vengono comunemente utilizzati per la congelazione altri tessuti. Questo manoscritto descrive un protocollo per congelamento rapido del muscolo scheletrico utilizzando isopentano (2-metilbutano) raffreddato con azoto liquido per mantenere ottimale la morfologia del muscolo scheletrico. Questa procedura è efficace anche per freezing tessuto destinati a studi di espressione genetica o proteine. Inoltre, abbiamo integrato il nostro protocollo di congelamento in un procedimento più ampio che descrive anche i metodi preferiti per il triage a breve termine di tessuto per (1) sola fibra studi funzionali e (2) coltura cellulare dei mioblasti, con un focus sullo sforzo minimo necessario per raccogliere tessuti e trasportarlo in ricerca o di riferimento laboratori specializzati per completare questi studi. Nel complesso, questo manoscritto fornisce una descrizione di come tessuto fresco può essere efficacemente distribuito per una varietà di studi fenotipici e quindi fornisce procedure operative standard (POS) per studi patologici legati alla malattia muscolare congenita.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il muscolo scheletrico è un tessuto strutturalmente e funzionalmente unico, e sono necessari per consentire la valutazione ottimale dei parametri strutturali e funzionali procedure di preparazione specializzati. Mentre una varietà di tessuti sono comunemente congelato per studi patologici in contesti clinici e di ricerca, protocolli di congelamento per tessuti non muscolari generalmente comportano la totale immersione del tessuto in OCT prima del congelamento. Come mostrato in figura 3, tale protocollo è inadatto per la valutazione patologica del muscolo scheletrico e tuttavia è abbastanza simile al protocollo qui descritto che ciò è un errore comunemente incontrati. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire un protocollo semplice per la corretta gestione del muscolo per evitare problemi come questo. Consigli è stato compilato sulla corretta manipolazione di muscoli per off-site fisiologico e studi cellulari nel tentativo di agevolare l'acquisizione di dati di alta qualità dai laboratori centrali esterne nei casi wheri studi sul posto non sono preferibili o possibile.
Come notato in questo protocollo, elementi che sono assolutamente essenziale per il corretto trattamento dei muscoli per studi patologici includono minimizzare il contenuto di acqua del tessuto, diminuendo la temperatura alla quale il muscolo è congelato, e aumentando la velocità con cui si ottiene il congelamento. Un'eccessiva umidità all'interno del tessuto o eccessiva lentezza del processo di congelamento (prodotto da temperature insufficienti o dalla mancanza di un contatto diretto tra l'agente e il congelamento del tessuto, come si incontra con azoto liquido) porterà a congelamento artefatti che possono alterare analisi patologica. Come Ottobre fornisce un'ulteriore fonte di umidità dei tessuti, molti laboratori usano altri adesivi come gomma adragante come substrato incorporamento. Anche nei casi in cui il congelamento viene eseguita in modo appropriato, occorre prestare attenzione per evitare di esemplari successivamente accidentalmente scongelamento attraverso il contatto con contenitori o strumenti RT.Così, un processo di congelamento successo richiede un grado di pianificazione che comprende un pre-raffreddamento di tutti gli strumenti e contenitori da utilizzare. Quando artefatti congelamento si incontrano, c'è un metodo qui descritto per il recupero del tessuto che è sufficiente per la maggior parte delle valutazioni patologiche. Tuttavia, questo ciclo di congelamento / scongelamento non offre perfetta istologia e ha il potenziale di compromettere altri studi molecolari o enzimatica del tessuto (oltre al tempo necessario per ri-congelare il tessuto), quindi utilizzando appropriate tecniche di congelamento iniziale è di gran lunga preferibile . Nei casi in cui il congelamento manufatto viene rilevata sul tessuto pre-congelato, tuttavia, la tecnica qui descritta può essere estremamente utile.
Fissazione e lavorazione di tessuti per EM in grado di offrire sfide tecniche specifiche che richiedono una pianificazione prima della raccolta del tessuto. L'errore più comune quando il prelievo dei campioni per EM prevede l'utilizzo di frammenti di tessuto che sono troppo spessi per glutaraldehyde di penetrare. Come glutaraldeide penetra solo circa 0,1 cm nel tessuto muscolare da una superficie data, la cura dovrebbe essere presa per assicurare che una dimensione dei campioni EM è più spesso di 0,2 centimetri. Inoltre, come EM è un ottimo mezzo per valutare direttamente l'apparato contrattile, alcuni ricercatori hanno sviluppato strategie di pre-tensione o pre-stiramento del muscolo prima della fissazione per consentire la misurazione di elementi contrattili ad una tensione fisiologicamente rilevanti. Non esiste un protocollo standard per il pre-tensionamento, ma due strategie sono brevemente descritte in questo protocollo. Va notato che i tentativi di pre-tensionamento del muscolo può produrre risultati imprevedibili se non sono fatte in modo molto specifico, e può essere preferibile fissare muscoli nello stato lasco per evitare modifiche artefatti di lunghezza sarcomero attraverso un non-standard procedura di pre-tensionamento 8,9. Per i muscoli in cui tali misure specifiche non sono necessarie (compresa la maggior parte biopsies eseguite per scopi clinici), sforzi di pre-tensionamento del muscolo non sono generalmente realizzati, e l'effetto principale sulla morfologia muscolare è una spaziatura non uniforme dei sarcomeri nel muscolo.
Questo documento rappresenta il primo di una serie di fornire SOP per l'esecuzione di prove in campo malattia muscolare congenita, e rappresenta gli sforzi di oltre 20 esperti del settore malattia muscolare congenita che abitualmente esegue cellulare, molecolare, funzionale, fisiologico e la ricerca patologica. Una gamma di POS pubblicati sarà reso disponibile nel corso del prossimo anno, ed i protocolli necessari e opportuni formati di pubblicazione per ciascuna sono stati discussi in un muscolo congenita malattia Consortium Workshop tenutosi nel mese di aprile del 2013 a Washington DC L'obiettivo di questo sforzo SOP è quello di fornire una tabella di marcia per la sperimentazione necessaria e l'analisi di campioni nel campo malattia muscolare congenita a 1) uniformare le pratiche e gli endpoint utilizzati nel nostro campo come male come possibile e 2) fornire istruzioni su pratiche standard per i nuovi ricercatori nel nostro campo. Noi crediamo che queste risorse potranno facilitare l'ingresso di nuovi ricercatori nel nostro campo sotto-studiato e migliorare la portata della ricerca che possono essere eseguite così. Inoltre, una standardizzazione delle pratiche sarà estremamente utile per confrontare i dati tra gli studi e per identificare gli endpoint per la pianificazione e l'esecuzione di studi preclinici e clinici.
Sebbene l'obiettivo principale di questo articolo è correlato al congelamento e preparazione di tessuti adatti per una varietà di studi, il gruppo di collaborazione anche discusso gli endpoint utili per l'analisi patologica dei campioni muscolari. Allo stato attuale, non vi è consenso ufficiale l'approccio da adottare quando si esegue l'analisi patologica, e una varietà di diversi studi vengono eseguiti a relazionarsi nuove scoperte a pubblicazioni precedenti per ciascuna malattia. Così, abbiamo pensato che sarebbe utileproporre alcune linee guida generali per la programmazione degli endpoint patologici nel muscolo patologia caratterizzazione. Prima di quantificare la patologia in uno studio, considerevole pensiero dovrebbe essere messo in 1) il metodo di misurazione della dimensione delle fibre, 2) la possibilità di anomalie fibra-specifico tipo o gli effetti del trattamento, 3) la possibilità di anomalie o effetti che sono limitati a singoli muscoli, e 4) una strategia per quantificare patologici che sono caratteristici per la malattia in studio. Dimensioni delle fibre è un endpoint necessario per la maggior parte degli studi, e purtroppo ci è ampia variazione nel modo in cui viene quantificato. Molti studi riportano questi risultati con i metodi di quantificazione automatici forniti dal software di imaging proprietario, ma molti di questi programmi prendono scorciatoie (come nell'ipotesi in cui le fibre sono cerchi o ellissi) che possono rendere queste misurazioni automatizzate imprecisa. E 'necessario capire come questi programmi automatici fanno le loro misurazioni brima di avere fiducia nelle misure e lo incoraggiano i ricercatori a comprendere questi dettagli nei metodi di carta. Inoltre, la misurazione specifico utilizzato per indicare la dimensione delle fibre è estremamente variabile, e alcune misure sono preferibili ad altri 10,11. Una misura comunemente usata di dimensioni delle fibre è l'area della sezione trasversale di fibra (CSA), in particolare perché gli investigatori effettuano studi fisiologici standardizzare i risultati di misurazioni CSA ottenuti utilizzando i loro strumenti. Purtroppo, mentre misure CSA possono riflettere accuratamente dimensioni delle fibre in sezioni trasversali perfette, sono ampiamente in funzione dell'orientamento fibra (nella misura in cui le fibre longitudinali o obliquamente sezionata avranno misurazioni artificialmente elevati CSA) e sono risultati così non ideali per dimensioni delle fibre. Una misura preferibile di dimensioni delle fibre che è meno dipendente fibra sezione trasversale è il diametro minimo di Feret (diametro MinFeret), che è la misura del secoloe diametro minore nella cellula muscolare 12. Questa misura è solo leggermente in funzione dell'orientamento della fibra ed è generalmente la clinica oro standard per la misura della fibra, e gli investigatori sono incoraggiati a muoversi verso l'uso di questa tecnica. Queste misure possono spesso essere effettuate utilizzando lo stesso software che genera le misurazioni CSA 13, ed è anche semplice da misurare manualmente. Per quanto riguarda la valutazione dei dati patologici secondo tipo di fibra, muscolo specifico, e nel contesto dei risultati patologici relative alla patologia specifica, questi sono argomenti meno controversi che dovrebbe essere considerato durante la progettazione di uno studio. Tipo di fibra può essere valutata mediante colorazione immunoistochimica o ATPasi, ma è utile considerare che i muscoli specifici e specie animali hanno specifiche miscele di tali tipi di fibre (che richiedono quindi diverse aspettative e strategie di sperimentazione). Muscle coinvolgimento patologico specifico o l'efficacia del trattamentopuò verificarsi, e il peso totale del muscolo rispetto ai controlli può essere utilizzato per identificare il grado di eterogeneità della malattia prima di decidere muscoli per valutare patologicamente. Infine, è noto che molte malattie muscolari sono associati ad alterazioni patologiche specifiche (quali steli in nemaline miopatia nemaline 14,15), e così è anche utile considerare se queste anomalie si trovano in un muscolo-fibra-tipo o distribuzione specifico quando si esegue l'analisi 16,17. Nel complesso, mentre noi non proponiamo una serie inflessibile di standard per la valutazione del muscolo, crediamo che tali questioni dovrebbero essere considerati prima della realizzazione di studi patologici in qualsiasi malattia del muscolo scheletrico.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
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