Triage de tejidos y de congelación para los modelos de la enfermedad del músculo esquelético
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
El músculo esquelético es un tejido único debido a su estructura y función, que requiere protocolos específicos para la recogida de tejidos para obtener óptimos resultados de las evaluaciones funcionales, celulares, moleculares y patológicos. Debido a la sutileza de algunas anormalidades patológicas visto en los trastornos musculares congénitas y el potencial para la fijación a interferir con el reconocimiento de estas características, la evaluación patológica de músculo congelado es preferible muscular fija la hora de evaluar el músculo esquelético para la enfermedad muscular congénita. Además, el potencial de producir artefactos de congelación graves en el músculo requiere precauciones específicas al congelar el músculo esquelético para el examen histológico que no se utiliza comúnmente cuando se congelan otros tejidos. Este manuscrito describe un protocolo para la congelación rápida del músculo esquelético utilizando isopentano (2-metilbutano) enfriado con nitrógeno líquido para preservar la morfología óptima músculo esquelético. Este procedimiento también es eficaz para freezing tejidos destinados a los estudios de expresión genética o de proteínas. Además, hemos integrado nuestro protocolo de congelación en un procedimiento más amplio que también describe los métodos preferidos para la clasificación a corto plazo del tejido de (1) los estudios funcionales de fibra única y (2) el cultivo celular de mioblastos, con un enfoque en el esfuerzo mínimo necesario para recoger tejidos y transportarlo a la investigación o laboratorios especializados de referencia para completar estos estudios. En general, este manuscrito proporciona un resumen de cómo el tejido fresco se puede distribuir de manera efectiva para una variedad de estudios fenotípicos y de ese modo proporciona los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) para estudios patológicos relacionados con la enfermedad muscular congénita.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
El músculo esquelético es un tejido estructural y funcionalmente único, y procedimientos especializados de preparación son necesarios para poder realizar una evaluación óptima de los parámetros estructurales y funcionales. Aunque una variedad de tejidos se congelan comúnmente para estudios patológicos en contextos clínicos y de investigación, los protocolos de congelación de los tejidos no musculares generalmente implican la inmersión total del tejido en octubre antes de la congelación. Como se muestra en la Figura 3, un protocolo de este tipo no es adecuado para la evaluación patológica de los músculos esqueléticos y sin embargo es lo suficientemente similar al protocolo descrito aquí que se trata de un error de comúnmente encontrado. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo sencillo para el manejo adecuado de los músculos para evitar problemas como éste. Consejos También se ha recopilado en el manejo adecuado de los músculos para fisiológica fuera de sitio y los estudios celulares, en un esfuerzo para facilitar la adquisición de datos de alta calidad en los laboratorios centrales del exterior en los casos where los estudios in situ no son preferibles o posible.
Como se señala en este protocolo, los elementos que son absolutamente esenciales en el procesamiento adecuado de músculo para estudios patológicos incluyen minimizar el contenido de agua del tejido, la disminución de la temperatura a la que se congela el músculo, y el aumento de la velocidad a la que se logra la congelación. El exceso de humedad en el tejido o la lentitud excesiva del proceso de congelación (producido por temperaturas insuficientes o por la falta de contacto directo entre el agente de congelación y el tejido, como se encuentra con nitrógeno líquido) dará lugar a la congelación de los artefactos que pueden afectar el análisis patológico. Como PTU dispone una fuente adicional de la humedad del tejido, muchos laboratorios utilizan otros adhesivos como goma de tragacanto como un sustrato de la incrustación. Incluso en los casos en que la congelación se lleva a cabo adecuadamente, se debe tener cuidado para evitar especímenes posteriormente descongelación accidentalmente a través del contacto con recipientes o instrumentos RT.Por lo tanto, un proceso de congelación con éxito requiere un cierto grado de planificación que incluye un pre-enfriamiento de todos los instrumentos y contenedores que se utilizarán. Cuando se encuentran artefactos de congelación, hay un método descrito aquí para la recuperación del tejido que es suficiente para la mayoría de las evaluaciones patológicas. Sin embargo, este ciclo de congelación / descongelación no ofrecer la histología perfecta y tiene el potencial de afectar otros estudios moleculares o enzimática del tejido (además del tiempo necesario para volver a congelar el tejido), por lo que el uso de prácticas apropiadas de congelación inicial es mucho más preferible . En los casos en que se encontró artefacto de congelación en el tejido de pre-congelados, sin embargo, la técnica descrita en este documento puede ser extremadamente útil.
La fijación y el procesamiento de tejido para ME ofrece desafíos técnicos específicos que requieren una planificación previa a la recogida de tejidos. El error más común en la recogida de muestras para EM implica el uso de fragmentos de tejido que son demasiado gruesas para glutaraldehyde para penetrar. Como glutaraldehído sólo penetra aproximadamente 0,1 cm en el tejido muscular de una superficie determinada, se debe tener cuidado para asegurarse de que una de las dimensiones de las muestras EM es no más gruesa que 0,2 cm. Además, como EM es un medio excelente para evaluar directamente el aparato contráctil, algunos investigadores han desarrollado estrategias de pre-tensión o estiramiento previo del músculo antes de la fijación para permitir la medición de los elementos contráctiles a una tensión fisiológicamente relevante. No existe un protocolo estándar para la pre-tensado, pero dos estrategias se describen brevemente en este protocolo. Cabe señalar que los intentos de pre-tensar el músculo puede producir resultados impredecibles a menos que se llevan a cabo de una manera muy específica, y puede ser preferible fijar los músculos en el estado de holgura para evitar cambios de artefactos en la longitud del sarcómero a través de un no estándar procedimiento de pretensado 8,9. Para que los músculos en que este tipo de medidas específicas no son necesarias (incluyendo la mayor parte biopsies realizados con fines clínicos), generalmente no se realizan esfuerzos para pre-tensión del músculo, y el principal efecto de la morfología muscular es una separación no uniforme de sarcómeros en el músculo.
Este trabajo representa la primera de una serie para proporcionar los SOP para la realización de las pruebas en el campo de la enfermedad muscular congénita, y representa el esfuerzo de más de 20 expertos en el campo de la enfermedad muscular congénita que es rutinario realizar celular, molecular y funcional, fisiológica y la investigación patológica. Se pondrá a disposición una serie de procedimientos normalizados de trabajo publicados durante el próximo año, y los protocolos necesarios y todos los formatos adecuados para cada se discutieron en un músculo de la Enfermedad congénita Consorcio taller celebrado en abril de 2013 en Washington DC El objetivo de este esfuerzo SOP es proporcionar una hoja de ruta para las pruebas necesarias y el análisis de muestras en el campo de la enfermedad muscular congénita a 1) estandarizar las prácticas y los criterios de valoración utilizados en nuestro campo como much como sea posible, y 2) proporcionar instrucción sobre las prácticas estándar para los nuevos investigadores en nuestro campo. Creemos que estos recursos facilitarán la entrada de nuevos investigadores en nuestro campo bajo estudiada y así mejorar el alcance de la investigación que se puede realizar. Además, una estandarización de las prácticas será de gran utilidad para comparar los datos entre los estudios e identificar los puntos finales en la planificación y la realización de los ensayos preclínicos y clínicos.
Mientras que el foco principal de este artículo está relacionado con la congelación y preparación de tejido apropiado para una variedad de estudios, nuestro grupo de colaboración también discutió los puntos finales útiles para el análisis patológico de los especímenes musculares. En la actualidad, no existe un consenso oficial sobre el enfoque a adoptar cuando se realiza el análisis patológico, y una variedad de diferentes estudios se llevan a cabo para relacionar los nuevos conocimientos a las publicaciones anteriores para cada enfermedad respectiva. Por lo tanto, pensamos que sería útil paraproponer algunas directrices generales para la planificación de los extremos patológicos en la musculatura caracterización patología. Antes de la cuantificación de la patología en un estudio, el pensamiento considerable se debe poner en 1) el método de medición del tamaño de la fibra, 2) la posibilidad de anomalías de tipo de fibra específico o efectos del tratamiento, 3) la posibilidad de alteraciones o efectos que se limitan a los músculos individuales, y 4) una estrategia para la cuantificación de los hallazgos patológicos que son característicos de la enfermedad en estudio. Tamaño de fibra es un punto final necesario para la mayoría de los estudios, y por desgracia hay una extensa variación en la forma en que se cuantifica. Muchos estudios reportan estos resultados usando métodos de cuantificación automatizadas proporcionadas por el software de imágenes de propiedad, pero muchos de estos programas toman atajos (como el supuesto de que las fibras son círculos o elipses), que puede hacer estas mediciones automatizadas inexacta. Es necesario entender cómo estos programas automatizados hacen sus mediciones bntes de tener confianza en las mediciones, y animamos a los investigadores a incluir estos detalles en los métodos de papel. Además, la medición específica utilizada para denotar tamaño de la fibra es extremadamente variable, y algunas mediciones son preferibles a otros 10,11. Una medida comúnmente utilizada de tamaño de la fibra es el área de sección transversal de la fibra (CSA), en particular porque los investigadores que realizan estudios fisiológicos estandarizar sus resultados con las mediciones de CSA obtenidos usando sus instrumentos. Desafortunadamente, mientras que las mediciones de CSA pueden reflejar con precisión el tamaño de la fibra en las secciones transversales perfectos, que dependen en gran medida en orientación de la fibra (en la medida en que las fibras longitudinales u oblicuamente seccionadas-tendrán mediciones artificialmente altos CSA) y son por lo tanto las mediciones no ideales para el tamaño de la fibra. Una medida preferible de tamaño de la fibra que es menos dependiente de fibra de área de sección transversal es el diámetro de la Feret mínimo (diámetro MinFeret), que es la medición de the diámetro menor en la célula muscular 12. Esta medida es sólo ligeramente dependientes orientación de las fibras y generalmente es el estándar de oro para la medición clínica de la fibra, y se anima a los investigadores a avanzar hacia el uso de esta técnica. Estas mediciones a menudo se pueden hacer usando el mismo software que genera mediciones CSA 13, y también son fáciles de medir manualmente. Con respecto a la evaluación de los datos patológicos de acuerdo con el tipo de fibra, músculo específico, y en el contexto de los hallazgos patológicos relacionados con la enfermedad específica, estos son temas menos controversiales que sólo deben tenerse en cuenta durante la planificación de un estudio. Tipo de fibra puede ser evaluada utilizando tinción inmunohistoquímica o ATPasa, pero es útil tener en cuenta que los músculos específicos y especies animales tienen mezclas específicas de estos tipos de fibras (necesitando por lo tanto diferentes expectativas y las estrategias de ensayo). Implicación patológica específica muscular o la eficacia del tratamientopuede ocurrir, y el peso total del músculo en comparación con los controles se puede utilizar para identificar el grado de heterogeneidad de la enfermedad antes de decidir sobre los músculos para evaluar patológicamente. Por último, es bien sabido que muchas enfermedades musculares están asociados con anomalías patológicas específicas (tales como varillas nemaline en miopatía nemalínica) 14,15, y por lo que también es útil considerar si estas anomalías se encuentran en un músculo de tipo fibra o -específica de distribución cuando se realiza el análisis 16,17. En general, aunque no proponemos un conjunto inflexible de normas para la evaluación de los músculos, creemos que estos temas deben ser considerados antes de la realización de los estudios patológicos en cualquier enfermedad del músculo esquelético.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
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