Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד
Summary
The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.
Abstract
שריר שלד הוא רקמה ייחודית בגלל מבנהו ותפקודו, אשר דורש פרוטוקולים ספציפיים לאיסוף רקמות כדי להשיג תוצאות אופטימליות מהערכות תפקודיות, סלולריות, מולקולריות, ופתולוגיים. בשל התחכום של כמה ליקויים פתולוגיים לראות בהפרעות שריר מולדות ופוטנציאל לקיבעון להפריע להכרה בתכונות אלה, הערכה פתולוגית של שריר קפוא עדיפה על שרירים קבועים בעת הערכת שרירי שלד למחלת שרירים מולדת. בנוסף, הפוטנציאל לייצר חפצי הקפאה חמורים בשריר דורש אמצעי זהירות מיוחדת בעת הקפאת שרירי שלד לבדיקה היסטולוגית, שאינם נפוץ בעת הקפאת רקמות אחרות. כתב יד זה מתאר פרוטוקול להקפאה מהירה של שריר שלד באמצעות isopentane (2 מתילבוטאן) מקוררת עם חנקן נוזלי כדי לשמור על מורפולוגיה שרירי שלד אופטימלית. הליך זה הוא גם יעיל עבור freezing רקמה מיועדת לביטוי במחקרים גנטיים או חלבון. יתר על כן, יש לנו משולב פרוטוקול ההקפאה שלנו להליך רחב יותר, המתאר גם שיטות מועדפות לקביעת סדרי העדיפויות לטווח הקצר של רקמה (1) לימודים תפקודיים סיב בודד ו( 2) תרבית תאים והיצמדות למנגנון, עם דגש על המאמץ המינימאלי הדרוש כדי לאסוף רקמות ולהעביר אותה למעבדות מחקר או התייחסות מיוחדות כדי להשלים את הלימודים האלה. בסך הכל, כתב היד הזה מספק קווי המתאר של כמה רקמות טריות יכולות להיות מופצות בצורה יעילה עבור מגוון רחב של מחקרים פנוטיפי ובכך מספק נהלי עבודה סטנדרטיים (SOPs) למחקרים פתולוגיים הקשורים למחלת שריר מולדת.
Introduction
Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation.
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models.
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.
Protocol
Representative Results
Discussion
שריר שלד הוא רקמה מבנית ופונקציונלי ייחודי, והליכי הכנה מיוחדים נחוצים כדי לאפשר ההערכה האופטימלית של פרמטרים מבניים ותפקודיים. בעוד מגוון רחב של רקמות קפואים בדרך כלל למחקרים פתולוגיים בהקשרים קליניים ומחקר, פרוטוקולי הקפאה לרקמות שריר שאינו כוללים בדרך כלל טבילה הכוללת של הרקמה ב אוקטובר לפני ההקפאה. כפי שניתן לראות באיור 3, פרוטוקול כזה אינו מתאים להערכה פתולוגית של שרירי שלד, ובכל זאת הוא דומה מספיק לפרוטוקול המתואר כאן כי מדובר בטעות בדרך נתקלה. המטרה של מאמר זה היא לספק לפרוטוקול פשוט לטיפול נאות של שרירים כדי למנוע בעיות כמו זה. ייעוץ גם כבר מלוקט על הטיפול נאות של שרירים לפיסיולוגיים מחוץ לאתר ומחקרים הסלולר במאמץ להקל על הרכישה של נתונים באיכות גבוהה על ידי מעבדות ליבה מחוץ במקרי wheמחדש את הלימודים באתר אינם עדיפים או אפשריים.
כפי שצוין בפרוטוקול זה, אלמנטים שהם חיוניים בעיבוד הנכון של שרירים ללימודים פתולוגיים כוללים מזעור תכולת המים של הרקמה, ומקטינה את הטמפרטורה שבה השרירים הוא קפוא, ולהגדיל את המהירות שבה הקפאה מושגת. לחות מוגזמת בתוך הרקמה או האיטיות מוגזמת של תהליך ההקפאה (המיוצר על ידי טמפרטורות מספיקות או על ידי חוסר קשר ישיר בין סוכן ההקפאה והרקמות, כפי שהוא נתקל עם חנקן נוזלי) תוביל להקפאת חפצים שיכולים לפגוע בניתוח פתולוגי. כאוקטובר מספק מקור נוסף ללחות רקמות, מעבדות רבות משתמשות בדבקים אחרים כמו נכאת מסטיק כמצע הטבעה. גם במקרים בי ההקפאה מבוצעת כראוי, יש להקפיד להימנע מדגימות לאחר מכן הפשירו בטעות באמצעות מגע עם מכולות או מכשירי RT.לפיכך, תהליך הקפאה מוצלח דורש מידה מסוימת של תכנון, הכוללת מראש מצמרר של כל המכשירים ומכולות לשימוש. כאשר חפצי הקפאה הם נתקלו, יש שיטה שתוארה כאן לשחזור של הרקמה שהיא מספיק עבור רוב הערכות פתולוגי. עם זאת, מחזור ההקפאה / הפשרה זו אינו מציע היסטולוגיה המושלמת ויש לו הפוטנציאל לפגוע במחקרים מולקולריים או אנזימטי אחרים של הרקמות (בנוסף לזמן הנדרש כדי להקפיא מחדש הרקמות), ולכן משתמש בשיטות הקפאה ראשוניות מתאימות היא במידה רבה עדיפה . במקרים בהם חפץ הקפאה הוא נתקל ברקמה טרום קפוא, לעומת זאת, הטכניקה המתוארת במסמך זה יכול להיות מאוד שימושי.
קיבעון ועיבוד של רקמה לEM יכול להציע אתגרים טכניים ספציפיים שדורשים תכנון מוקדם לאוסף רקמות. השגיאה הנפוצה ביותר בעת איסוף דגימות לEM כרוכה בשימוש שבברי רקמות כי הם עבים מדי לglutaraldehydדואר לחדור. כglutaraldehyde חודר כ 0.1 סנטימטר בלבד לתוך רקמת שריר משטח, טיפול שניתן יש לנקוט כדי להבטיח שממד אחד של דגימות EM הוא לא עבה יותר 0.2 סנטימטר. בנוסף, כEM הוא אמצעי מצוין ישירות הערכת מנגנון ההתכווצות, כמה חוקרים פיתחו אסטרטגיות מראש מתח או טרום מתיחת השרירים לפני הקיבוע כדי לאפשר המדידה של אלמנטי התכווצות במתח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אין פרוטוקול סטנדרטי לטרום מתיחה, אך שתי אסטרטגיות מתוארות בקצרה בפרוטוקול זה. יצוין כי ניסיונות מראש tensioning השריר יכול להפיק תוצאות בלתי צפויות, אלא אם כן הם נעשים בצורה מאוד מסוימת, וזה עשוי להיות עדיף לתקן את השרירים במצב הרפוי כדי למנוע שינויי artifactual באורך sarcomere דרך לא סטנדרטי 8,9 הליך טרום מתיחה. לשרירים שבמדידות ספציפיות כגון אינן נחוצות (כוללים רוב בiopsies נעשה למטרות קליניות), מאמצים מראש מתח השרירים הם בדרך כלל לא נעשו, וההשפעה העיקרית על מורפולוגיה שרירים היא מרווח לא אחיד של sarcomeres בשריר.
נייר זה מייצג הראשון בסדרה לספק SOPs לביצוע בדיקות בתחום מחלת השריר המולדים, והיא מייצגת את המאמצים של מעל 20 מומחים בתחום מחלת השריר המולדים כי באופן שיגרתי לבצע סלולארי, מולקולרי, פונקציונלי, פיסיולוגי, ו מחקר פתולוגי. מגוון רחב של נהלי עבודה שפורסמו יהיה זמין בשנה הקרובה, והפרוטוקולים הנחוצים ופורמטי פרסום מתאימים לכל נדונו בשריר מולדת מחלות Consortium סדנה שנערך בחודש אפריל של 2013 בוושינגטון מטרת מאמץ SOP זה היא לספק מפת דרכים לבדיקת הצורך והניתוח של דגימות בתחום מחלת השריר המולדים ל1) סטנדרטיזציה של שיטות העבודה ונקודתי קצה בשימוש בתחום שלנו כמו מ 'uch ככל האפשר, ו2) לספק הדרכה על שיטות סטנדרטיות לחוקרים חדשים בתחום שלנו. אנו מאמינים כי משאבים אלה יאפשר את כניסתם של חוקרים חדשים בשדה תחת נלמד שלנו ובכך לשפר את היקף המחקר שניתן לבצע. בנוסף, סטנדרטיזציה של שיטות עבודה תהיה מאוד מועילה כדי להשוות נתונים בין מחקרים ולזהות נקודות קצה בעת תכנון וביצוע ניסויים פרה קליניים.
למרות ההתמקדות העיקרית של מאמר זה קשור להקפאה המתאימה וההכנה של רקמה למגוון רחב של מחקרים, הקבוצה המשותפת שלנו דנה גם בנקודתי הקצה השימושיים לניתוח הפתולוגי של דגימות שריר. נכון לעכשיו, אין הסכמה רשמית על הגישה שיש לנקוט כאשר ביצוע ניתוח פתולוגי, ומגוון רחב של מחקרים שונים שבוצע להתייחס ממצאים חדשים לפרסומים קודמים לכל מחלה, בהתאמה. לכן, חשב שזה יהיה שימושי כדימציע כמה הנחיות כלליות לתכנון של נקודות קצה פתולוגיים באפיון הפתולוגיה שריר. לפני כימות פתולוגיה במחקר, מחשבה רבה צריכה להיות הכניסה לתוך 1) השיטה של מדידת גודל סיבים, 2) את האפשרות של מומים סיבים מסוג ספציפי או השפעות טיפול, 3) את האפשרות של מומים או תופעות שמוגבלות לשרירים בודדים, ו4) אסטרטגיה לכימות ממצאים פתולוגיים אופייניים למחלה הנחקרת. גודל סיבים הוא נקודת סיום הכרחית עבור רוב המחקרים, ולמרבה הצער יש וריאציה רבה באיך זה הוא לכמת. מחקרים רבים מדווחים על תוצאות אלו בשיטות כימות אוטומטיות המסופקות על ידי תוכנת הדמיה קניינית, אך רבים מתוכניות אלה לקחת קיצורי דרך (כמו הנחה שהסיבים הם עיגולים או אליפסות) שיכול להפוך המדידות האוטומטיות הללו לא מדויקות. יש צורך להבין כיצד התוכניות האוטומטיות האלה עושות ב המדידות שלהםefore שיש אמון במדידות, ואנו ממליצים לחוקרים כוללים את פרטים אישיים בשיטות נייר. בנוסף, המדידה הספציפית המשמשת לציון גודל סיבים היא מאוד משתנה, וכמה מדידות עדיפות לאחרים 10,11. מדידה נפוצות של גודל סיבים היא אזור סיבי החתך (CSA), בעיקר משום שחוקרים בביצוע מחקרים פיסיולוגיים לתקנן את התוצאות שלהם למדידות CSA שהושגו תוך שימוש במכשירים שלהם. למרבה הצער, בזמן מדידות CSA יכולות לשקף במדויק גודל סיבים בסעיפים רוחביים מושלמים, הם בהרחבה תלויות בכיוון סיבים (עד כדי כך שסיבי אורך או באלכסון המחולק יהיו מדידות CSA גבוהות באופן מלאכותי) ומדידות ולכן לא אידיאליים לגודל סיבים. מדידה עדיפה בגודל סיבים שהיא פחות תלוי בשטח החתך של סיבים היא בקוטר של Feret המינימום (קוטר MinFeret), המהווה את המדידה של הקוטר מינור בתא השריר 12. מדידה זו היא תלויה אך ורק מעט בכיוון סיבים, והוא בדרך כלל זהב הסטנדרטי למדידת סיבים הקליני, וחוקרים מוזמנים להתקדם לקראת השימוש בטכניקה זו. מדידות אלה לעתים קרובות יכולים להתבצע באמצעות אותה התוכנה שיוצרת מדידות CSA 13, והם גם פשוטים למדידה באופן ידני. עם כל כבוד להערכת הנתונים הפתולוגיים בהתאם לסוג סיבים, שרירים ספציפיים, ובהקשר של ממצאים פתולוגיים הקשורים למחלה הספציפית, אלה נושאים פחות שנויים במחלוקת שצריך רק לקחת בחשבון בעת תכנון מחקר. סוג הסיבים ניתן להעריך באמצעות מכתים immunohistochemical או ATPase, אבל כדאי לקחת בחשבון שיש לי שרירים ספציפיים ומינים של בעלי חיים מסוימים תערובות של סוגים אלה סיבים (דבר שיחייבו את ציפיות שונות ובדיקת אסטרטגיות). מעורבות שרירים ספציפית פתולוגי או יעילות טיפוליכול להתרחש, ומשקל שרירים בסך הכל בהשוואה לקבוצת ביקורת יכול לשמש כדי לזהות את מידת ההטרוגניות של מחלה לפני שמחליט על השרירים כדי להעריך באופן פתולוגי. לבסוף, כידוע, מחלות שריר רבות הקשורים לליקויים ספציפיים פתולוגי (כגון מוטות nemaline במיופתיה nemaline) 14,15, ואז זה שימושי גם כדי לשקול אם ליקויים אלה נמצאים בסיב שריר מסוג או ספציפי להפצה בעת ביצוע הניתוח 16,17. בסך הכל, בזמן שאנחנו לא מציעים סט נוקשה של סטנדרטים להערכת שריר, אנו מאמינים כי נושאים אלה צריכים להיחשב לפני ביצוע מחקרים פתולוגיים בכל מחלה שרירי שלד.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.
Materials
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| Materials | |||
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 mL conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 mL, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated Styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Reagents | |||
| Tissue Freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 mL) | Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 mL of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 mL of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| Storage requriements | |||
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications | |||
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
