Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skelettmuskel ist ein strukturell und funktional einzigartige Gewebe und spezialisierte Herstellungsverfahren erforderlich, um die optimale Beurteilung der strukturellen und funktionellen Parameter erlaubt sind. Während eine Vielzahl von Geweben werden üblicherweise für pathologische Untersuchungen in klinischen und Forschungskontexten gefroren Gefrierverfahren für Nicht-Muskelgewebe gewöhnlich die Gesamteintauchen des Gewebes in OCT vor dem Einfrieren. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, ist ein solches Protokoll für die pathologische Bewertung der Skelettmuskel nicht geeignet und ist ähnlich genug ist, um das hier beschriebene Protokoll, dass dies eine häufig auftretende Fehler vorhanden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein einfaches Protokoll für den richtigen Umgang mit Muskel bieten, um Fragen wie diese zu vermeiden. Beratung ist auch auf die richtige Handhabung der Muskel für Off-Site-physiologischen und zellulären Studien in dem Bemühen, den Erwerb von qualitativ hochwertigen Daten, die von außerhalb der Kern Labors, erleichtern zusammengestellt where Vor-Ort-Studien sind nicht bevorzugt oder möglich ist.

Wie in diesem Protokoll angegeben, Elemente, die für die pathologische Studien in der richtigen Verarbeitung von Muskel unbedingt erforderlich sind, umfassen eine Minimierung der Wassergehalt des Gewebes, die Verringerung der Temperatur, bei der der Muskel eingefroren, und die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der Gefrierpunkt erreicht wird. Mäßiger Feuchtigkeit im Gewebe oder übermäßige Langsamkeit des Gefrierprozesses (durch unzureichende Temperaturen oder durch fehlende direkte Kontakt zwischen der Vereisungsmittel und dem Gewebe, hergestellt als mit flüssigem Stickstoff angetroffen wird) wird dem Einfrieren Artefakte, die pathologische Analyse beeinträchtigen können. Wie Oktober eine zusätzliche Quelle der Feuchtigkeit der Gewebe, viele Labors verwenden andere Klebstoffe wie Tragant als Einbettungssubstrat. Selbst in Fällen, wo das Gefrieren angemessen durchgeführt wird, sollte darauf geachtet werden, um anschließend zufällig Auftauen Proben durch Kontakt mit RT Behälter oder Instrumente zu vermeiden.So eine erfolgreiche Gefrierprozess erfordert ein gewisses Maß an Planung, die eine Pre-chilling aller Instrumente und Behälter verwendet werden umfasst. Beim Einfrieren Artefakte auftreten, besteht die für die Wiederherstellung des Gewebes, das für die meisten pathologischen Bewertungen hier beschriebenen Verfahren. Allerdings bedeutet dies Frost / Tau-Zyklus nicht bieten perfekte Histologie und hat das Potenzial, andere molekulare oder enzymatische Untersuchungen des Gewebes (zusätzlich zu der Zeit benötigt, um wieder einfrieren das Gewebe) beeinträchtigen, so mit geeigneten Anfangs Einfrieren Praktiken vorziehen, . In Fällen, in denen das Einfrieren Artefakte auf vorgefrorene Gewebe angetroffen wird jedoch die hier beschriebene Technik kann sehr nützlich sein.

Fixierung und Verarbeitung von Gewebe für die EM können bestimmte technische Herausforderungen, die Planung vor der Gewebesammlung erfordern bieten. Der häufigste Fehler beim Sammeln von Proben für die EM ist die Verwendung von Gewebefragmente, die zu dick sind für Glutaraldehyde zu durchdringen. Wie Glutaraldehyd dringt nur etwa 0,1 cm in das Muskelgewebe aus einer gegebenen Oberfläche, sollte darauf geachtet werden, dass eine Dimension der EM Proben nicht dicker als 0,2 cm. Zusätzlich, wie EM ist ein ausgezeichnetes Mittel zur direkten Auswertung des kontraktilen Apparates, einige Forscher haben Strategien entwickelt, um vorspannen oder Vorstreckung der Muskel vor der Fixierung, um die Messung der kontraktilen Elemente bei einem physiologisch relevanten Spannung zu ermöglichen. Es gibt kein Standardprotokoll für die Vorspannung, sondern zwei Strategien werden kurz in diesem Protokoll beschrieben. Es ist zu beachten, dass vor Spannen der Muskel kann zu unvorhersehbaren Ergebnissen führen, wenn sie nicht in einer ganz bestimmten Art und Weise getan, und es kann von Vorteil sein, die Muskeln im schlaffen Zustand zu fixieren, um Artefakt Veränderungen in Sarkomerlänge durch einen Nicht-Standard zu verhindern versucht werden Vorspannverfahren ^8,9. Für Muskeln, in denen diese spezifischen Messungen sind nicht erforderlich (einschließlich der meisten biopsies für klinische Zwecke durchgeführt), Anstrengungen zur Vorspannung des Muskels in der Regel nicht aus, und die Hauptwirkung auf Muskel-Morphologie ist eine nicht-gleichförmigen Abstand von Sarkomeren in den Muskel.

Dieses Papier stellt die erste in einer Reihe auf SOPs für die Durchführung von Prüfungen im Bereich angeborene Muskelerkrankungen bereitzustellen, und es steht für die Bemühungen von mehr als 20 Experten in der angeborenen Muskelerkrankung Feld, die routinemäßig zelluläre, molekulare, funktionelle, physiologische durchzuführen, und pathologische Forschung. Eine Reihe von SOPs veröffentlicht wird im kommenden Jahr zur Verfügung gestellt werden, und die notwendigen Protokolle und geeignete Formate für jede Veröffentlichung wurden mit einer angeborenen Muskelerkrankung Consortium Werkstatt im April 2013 in Washington DC erörtert Das Ziel dieser Bemühungen ist es, SOP bieten ein Fahrplan für die notwendige Prüfung und Analyse der Proben im Bereich angeborene Muskelerkrankung zu 1) zu standardisieren, die Praktiken und Endpunkte in unserem Bereich als m verwendetuch wie möglich, und 2) bieten Unterricht auf Standard-Verfahren für neue Forscher in unserem Bereich. Wir glauben, dass diese Ressourcen den Markteintritt neuer Ermittler in unsere untersuchten Bereich zu erleichtern und verbessern so den Umfang der Forschung, die durchgeführt werden können. Zusätzlich wird eine Vereinheitlichung der Praxis als äußerst hilfreich, um Daten über Studien zu vergleichen und identifizieren Endpunkte bei der Planung und Durchführung von präklinischen und klinischen Studien.

Auch wenn der Schwerpunkt dieses Artikels wird in den entsprechenden Einfrieren und Vorbereitung von Gewebe für eine Vielzahl von Studien verwandt, unsere gemeinsame Gruppe diskutierte auch über die nützliche Endpunkte für den pathologischen Analyse von Muskel-Proben. Derzeit gibt es keine offizielle Konsens über die Vorgehensweise bei der Durchführung von pathologischen Analyse zu nehmen, und eine Vielzahl von verschiedenen Studien werden durchgeführt, um neue Erkenntnisse zu früheren Publikationen für die jeweiligen Krankheiten beziehen. So, dachten wir, dass es sinnvoll zu sein,einige allgemeine Richtlinien für die Planung von pathologischen Endpunkten in Muskel Pathologie Charakterisierung vorschlagen. Vor der Quantifizierung der Pathologie in einer Studie, sollten erhebliche Gedanken in 1 die Methode der Fasergrößenmessung gestellt werden), 2) die Möglichkeit, Fasertyp-spezifischen Anomalien oder Behandlungseffekte, 3) die Möglichkeit, Anomalien oder Effekte, die eingeschränkt werden die einzelnen Muskeln und 4) eine Strategie zur Quantifizierung pathologische Befunde, die charakteristisch für die Krankheit untersucht werden. Fiber ist eine notwendige Größe Endpunkt für die meisten Studien, und leider gibt es umfangreiche Variation, wie es quantifiziert wird. Viele Studien berichten diese Ergebnisse mit Hilfe automatisierter Verfahren zur Quantifizierung von proprietären Imaging-Software zur Verfügung gestellt, aber viele dieser Programme nehmen Abkürzungen (wie unter der Annahme, dass die Fasern Kreise oder Ellipsen), die diese automatisierten Messungen ungenau wiedergeben können. Es ist notwendig zu verstehen, wie diese automatisierte Programme machen ihre Messungen bevor mit Vertrauen in den Messungen, und wir ermutigen die Ermittler, diese Details in Papier Methoden umfassen. Zusätzlich ist die spezifische Messung verwendet, um Fasergröße bezeichnen äußerst variabel, und einige Daten sind gegenüber anderen bevorzugt ^10,11. Eine häufig verwendete Messung der Fasergröße ist der Faserquerschnittsfläche (CSA), vor allem, weil die Ermittler Durchführung physiologische Studien zu standardisieren ihre Ergebnisse CSA Messungen mit ihren Instrumenten erhalten. Leider, während CSA Messungen genau widerspiegeln Fasergröße in perfekter Querschnitten, sind sie weitgehend abhängig von der Faserorientierung (in dem Maße, längs oder schräg geschnittene Fasern künstlich hoch CSA Messungen) und sind somit nicht ideal für Messungen Fasergröße. Eine bevorzugte Messung der Fasergröße, die weniger abhängig von der Faserquerschnittsfläche ist die minimale Feret-Durchmesser (MinFeret Durchmesser), die die Messung von the-Moll Durchmesser in der Muskelzelle ^12. Die Messung ist nur wenig abhängig von Faserorientierung und ist in der Regel die klinische Goldstandard für Lichtmessung, und Ermittler sind aufgefordert, auf die Verwendung dieser Technik zu bewegen. Diese Messungen können häufig unter Verwendung der gleichen Software, die CSA Messungen ¹³ erzeugt werden, und sind auch einfach manuell zu messen. In Bezug auf die Bewertung der pathologischen Daten nach Fasertyp, bestimmte Muskel, und im Rahmen der pathologischen Befunde von der jeweiligen Krankheit bezogen, das sind weniger kontroversen Themen, die gerade bei der Planung einer Studie berücksichtigt werden sollten. Fasertyp kann unter Verwendung immunhistochemischer oder ATPase-Färbung ausgewertet werden, aber es ist sinnvoll zu berücksichtigen, dass bestimmte Muskeln und Tierarten haben spezielle Mischungen dieser Fasertypen (also erfordern unterschiedliche Erwartungen und Teststrategien). Muskel-spezifischen pathologischen Beteiligung oder die Wirksamkeit der Behandlungauftreten können, und die Gesamtmuskelmasse im Vergleich zu Kontrollen verwendet werden, um den Grad der Heterogenität der Krankheit vor der Entscheidung über die Muskeln, um krankhaft bewerten zu identifizieren. Schließlich ist es bekannt, dass viele Muskelkrankheiten mit spezifischen pathologischen Veränderungen (wie Nemalin Stangen Nemalin Myopathie) ^14,15 verbunden ist, und so ist es auch nützlich, um zu prüfen, ob diese Abweichungen werden in einem Fasertyp-oder Muskel gefunden spezifische Verteilung bei der Durchführung der Analyse ^16,17. Insgesamt, während wir eine unflexible Reihe von Standards für die Bewertung der Muskel nicht vor, so glauben wir, dass diese Fragen vor der Durchführung von pathologischen Untersuchungen in jeder Skelettmuskelerkrankung angesehen werden.