Une préparation semi-intact d'isolement de la souris vestibulaire épithélium sensoriel pour électrophysiologie et haute résolution microscopie à deux photons
Summary
Analyse de la fonction des cellules ciliées vestibulaires est compliquée par leur localisation profonde dans la partie la plus difficile du crâne, l'os temporal rocher. La plupart des études sur les cellules capillaires fonctionnels ont utilisé intensément les cellules ciliées isolées. Nous décrivons ici une préparation semi-intactes de souris épithélium vestibulaire pour les études de microscopie électrophysiologiques et à deux photons.
Abstract
Comprendre les cellules ciliées vestibulaires fonctionnent dans des conditions normales, ou comment un traumatisme, la maladie et le vieillissement perturber cette fonction est une étape essentielle dans le développement d'approches préventives et / ou de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, la majorité des études portant sur la fonction vestibulaire anormal n'ont pas été au niveau cellulaire mais porté principalement sur des analyses comportementales des troubles vestibulaires telles que les analyses de la marche et de la performance réflexe vestibulo-oculaire. Bien que ce travail a donné de précieuses informations sur ce qui se passe quand les choses vont mal, peu d'informations ont été glanées sur les causes sous-jacentes de dysfonctionnement. Parmi les études qui se concentrent sur les processus cellulaires et sous-cellulaires qui sous-tendent la fonction vestibulaire, la plupart ont invoqué aiguë cellules ciliées isolés, dépourvus de leurs connexions synaptiques et de l'environnement de la cellule d'appui. Par conséquent, un défi technique majeur a été l'accès aux cellules ciliées vestibulaires extrêmement sensible dans un preparation qui est moins perturbé, physiologiquement. Ici, nous démontrons une préparation semi-intactes de la souris épithélium vestibulaire sensoriel qui conserve le micro-environnement local, y compris des cellules ciliées / complexes afférentes primaires.
Introduction
Malgré l'importante contribution du système vestibulaire de notre vie quotidienne, une bonne compréhension des processus responsables de la baisse observée dans la fonction vestibulaire avec l'âge reste insaisissable. Une des raisons de ce manque de connaissances est que le déclin de la fonction vestibulaire a presque exclusivement été explorée en utilisant des tests comportementaux, y compris le réflexe vestibulo-oculaire (VOR), un indicateur précis de la fonction vestibulaire extrinsèque, mais donne un aperçu limité dans les changements de composantes intrinsèques . Il s'agit d'un obstacle majeur à notre compréhension de la fonction des cellules ciliées vestibulaires dans la santé, la maladie ou le vieillissement.
Même s'il ya eu de nombreuses études sur les cellules ciliées vestibulaires individuels, une lacune majeure a été le recours à des préparations de cellules de cheveux courte durée, où les cellules ciliées et les terminaisons afférentes même calice sont retirés de leur environnement normal via un traitement mécanique et / ou enzymatique. Approches telles inéviBly perturber la microarchitecture délicat entre cellules ciliées et le calice, et les cheveux cellule et la cellule de soutien. Avec le développement de préparations semi-intactes 1-5, et une souris préparation du labyrinthe isolé 6, il ya maintenant une occasion d'étudier les différentes formes de communication synaptique dans des conditions qui ressemblent davantage à celles in vivo. En effet, Lim et al. (2011) ont montré des différences marquées dans les courants de cellules entières enregistrées à partir du type aigu isolé je cellules ciliées vestibulaires rapport à ceux qui sont restés ancrés dans le neuroépithélium. Plus précisément, le potassium est pensé pour s'accumuler dans l'espace intercellulaire, entre la cellule de cheveux et le calice afférente, et modifie considérablement la réponse des cellules de cheveux 7. Ce type d'information serait impossible à obtenir sans la préparation semi-intact de l'épithélium vestibulaire sensoriel décrit ici. Nous démontrons la préparation semi-intactes de la crête souris 3Et montrer des résultats représentatifs obtenus à partir de cellules entières correctif électrophysiologie et d'imagerie calcique biphotonique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les mécanismes qui sous-tendent notre sens de l'équilibre ont reçu une attention limitée en comparaison avec d'autres systèmes sensoriels, par exemple, les systèmes visuels et auditifs. Parmi les études qui ont examiné les changements dans la fonction vestibulaire ou de l'équilibre, la plupart ont mis l'accent sur des mesures comportementales, y compris le réflexe vestibulo-oculaire, avec une connaissance incomplète des composantes fondamentales de-la balance cellules ciliées vestibu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de ce travail a été fourni par un Passe Garnett et Rodney Williams Memorial Foundation subvention de projet de R. Lim et AJ Camp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
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