Una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de Electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones
Summary
Análisis de la función de las células ciliadas vestibulares se complica por su ubicación en lo profundo de la parte más dura del cráneo, hueso temporal pétreo. La mayoría de los estudios de células pilosas funcionales han utilizado intensamente células ciliadas aislados. A continuación se describe una preparación semi-intacta de ratón epitelio vestibular para estudios electrofisiológicos y de microscopía de dos fotones.
Abstract
Comprensión de las células ciliadas vestibulares funcionan en condiciones normales, o cómo el trauma, la enfermedad y el envejecimiento interrumpir esta función es un paso vital en el desarrollo de enfoques preventivos y / o nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, la mayoría de los estudios en busca de la función vestibular anormal no han sido a nivel celular pero centrado principalmente en ensayos de comportamiento de la disfunción vestibular, tales como los análisis de la marcha y el rendimiento reflejo vestíbulo-ocular. Si bien este trabajo ha dado información valiosa sobre lo que sucede cuando las cosas van mal, hay poca información obtenida sobre las causas subyacentes de la disfunción. De los estudios que se centran en los procesos celulares y subcelulares que subyacen a la función vestibular, la mayoría han confiado en forma aguda las células ciliadas aislados, desprovistos de sus conexiones sinápticas y el entorno celular de soporte. Por lo tanto, un importante reto técnico ha sido el acceso a las células ciliadas vestibulares exquisitamente sensibles en una preparaciónración que está menos perturbado, fisiológicamente. Aquí se demuestra una preparación semi-intacta del ratón epitelio sensorial vestibular que conserva el micro-entorno local, incluyendo las células ciliadas / complejos aferentes primarias.
Introduction
A pesar de la importante contribución del sistema vestibular en nuestra vida diaria, una clara comprensión de los procesos responsables de la disminución observada en la función vestibular con la edad, siendo difícil de alcanzar. Una razón para esta falta de conocimiento es que la disminución de la función vestibular ha sido casi exclusivamente explorado el uso de ensayos de comportamiento, incluyendo el reflejo vestíbulo-ocular (VOR), un indicador preciso de la función vestibular extrínseca, pero proporciona información limitada sobre los cambios de los componentes intrínsecos . Esto es un obstáculo importante para nuestra comprensión de la función de las células ciliadas vestibulares en la salud, la enfermedad o el envejecimiento.
Aunque ha habido muchos estudios sobre las células ciliadas vestibulares individuales, una deficiencia importante ha sido la dependencia de las preparaciones de células de cabello agudos, en los que las células capilares y terminales aferentes incluso cáliz son retirados de su ambiente normal mediante tratamiento mecánico y / o enzimática. Tal enfoques inevitablea perturbar el delicado microarquitectura entre las células ciliadas y del cáliz, y el pelo de células y células de apoyo. Con el desarrollo de preparaciones semi-intacta 1-5, y un ratón aislado preparación laberinto 6, ahora existe la oportunidad de estudiar las distintas formas de comunicación sináptica en condiciones que se parecen más a los de vivo. En efecto, Lim et al. (2011) mostró marcadas diferencias en las corrientes de células enteras grabadas de tipo agudo aislado células ciliadas vestibulares I en comparación con aquellos que permanecieron incrustados dentro del neuroepitelio. Específicamente, se cree potasio a acumularse en el espacio intercelular, entre la célula de pelo y cáliz aferente, y altera significativamente la respuesta de la célula de pelo 7. Este tipo de información sería imposible de obtener sin la preparación semi-intacta del epitelio sensorial vestibular se describe aquí. Se demuestra la preparación semi-intacta del ratón crista 3, Y muestran resultados representativos obtenidos de parche de células enteras de electrofisiología y de imágenes de calcio de dos fotones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los mecanismos que subyacen a nuestro sentido del equilibrio han recibido poca atención en comparación con otros sistemas sensoriales, por ejemplo, los sistemas visual y auditivo. De los estudios que han investigado los cambios en la función vestibular o el balance, la mayoría se han centrado en medidas conductuales como el reflejo vestíbulo-ocular, con un conocimiento incompleto de los pilares fundamentales de la balanza de las propias células ciliadas vestibulares de construcción. Los estudios que se h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación de este trabajo fue proporcionado por un Passe Garnett y Williams subvención Proyecto Memorial Foundation Rodney R. Lim y AJ Camp.
Materials
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A |
References
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